La exposición a nanoplásticos aniónicos induce fugas endoteliales

Aug 13, 2023

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4757 (2022) Citar este artículo

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La producción de plásticos a escala mundial ha sido fundamental para el avance de la sociedad moderna, mientras que la creciente acumulación de plásticos en los vertederos, los océanos y todo lo demás se ha convertido en un importante factor de estrés para la sostenibilidad ambiental, el clima y, potencialmente, la salud humana. Si bien las fuerzas mecánicas y químicas del hombre y la naturaleza pueden eventualmente descomponer o reciclar los plásticos, nuestra comprensión de las huellas dactilares biológicas de los plásticos, especialmente de los nanoplásticos, sigue siendo deficiente. Aquí informamos sobre un fenómeno asociado con las formas nanoplásticas de poliestireno aniónico y poli(metacrilato de metilo), donde su introducción interrumpió las uniones de cadherina endotelial vascular de una manera dependiente de la dosis, según lo revelado por microscopía de fluorescencia confocal, vías de señalización, simulaciones de dinámica molecular. , así como ensayos ex vivo e in vivo con sistemas de modelos animales. En conjunto, nuestros resultados implicaron que la permeabilidad vascular inducida por nanoplásticos es principalmente de naturaleza biofísica-bioquímica, sin correlación con eventos citotóxicos como la producción de especies reactivas de oxígeno, la autofagia y la apoptosis. Esta ruta descubierta de transporte paracelular ha abierto grandes caminos para investigar el comportamiento y los efectos biológicos de los nanoplásticos, lo que puede ofrecer información crucial para guiar las innovaciones hacia una industria de plásticos sostenible y la remediación ambiental.

Los microplásticos y los nanoplásticos son derivados de la degradación física, química y biológica de los plásticos vertidos en el medio ambiente, desde puntos de venta industriales y de investigación, o como subproductos de productos básicos como ropa, champús y bolsitas de té de plástico1. Con el aumento constante de la producción mundial de plásticos durante el siglo pasado, alcanzando los 359 millones de toneladas solo en 20182, comprender y mitigar los efectos biológicos adversos de estos materiales creados por el hombre3, especialmente en sus formas microplásticas y nanoplásticas, se ha vuelto crucial para la protección. de la salud humana y la sostenibilidad ambiental, preservando al mismo tiempo la forma de vida moderna.

Se han encontrado trazas de plásticos en órganos animales y humanos por inhalación, ingestión y exposición dérmica, como resultado de su prevalencia en el aire, el agua y el suelo4,5. A diferencia de sus contrapartes de tamaño micro y más estudiados en área de superficie por volumen y perfil de toxicidad, los nanoplásticos pueden afectar el crecimiento, la reproducción y el metabolismo de los animales6,7,8,9 y comprometer el sistema inmunológico al elevar la secreción de citocinas, la apoptosis y el estrés del retículo endoplásmico y estrés oxidativo10,11,12,13.

Recientemente, se informó que las nanopartículas inorgánicas aniónicas como TiO2, SiO2, oro y nanodiamantes en un rango de tamaño determinado (es decir, <100 nm), pueden alterar las uniones de cadherina endotelial vascular (cadherina-VE) para crear uniones transitorias de micrones. Aberturas físicas de tamaño mediano en monocapas endoteliales14,15. Este fenómeno, denominado fuga endotelial inducida por nanomateriales (NanoEL), tiene implicaciones significativas para la nanotoxicología y la nanomedicina, donde las nanoestructuras están diseñadas para administrar fármacos o detectar anomalías tisulares a través de su circulación vascular16, lo que implica su translocación a través de la barrera hematoencefálica ( BBB) a veces. En este estudio, informamos sobre un fenómeno biológico asociado con la exposición a nanoplásticos, en forma de fugas endoteliales en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) provocadas por los nanomateriales. Este hallazgo es sorprendente porque (1) los nanoplásticos son materiales poliméricos que no se sabe que induzcan NanoEL16, y (2) las densidades de los nanoplásticos, es decir, ∼1,05 g/m3 para poliestireno y ∼1,18 g/m3 para poli(metacrilato de metilo) (PMMA), son considerablemente inferiores al umbral de 1,72 g/m3 determinado para las nanopartículas inorgánicas competentes para NanoEL17. Específicamente, examinamos los mecanismos moleculares de la ruptura del dímero de cadherina VE por los nanoplásticos de poliestireno y PMMA mediante simulaciones de dinámica molecular, y documentamos más la fuga endotelial ex vivo con venas de conejos y cerdos e in vivo con ratones expuestos a los nanoplásticos. Este estudio implicó la permeabilidad de la vasculatura como un mecanismo para el transporte paracelular de nanoplásticos, llenando un vacío de conocimiento crucial en nuestra búsqueda de comprender el comportamiento biológico y el destino de los plásticos que abarrotan la ecosfera.

La morfología y el diámetro hidrodinámico del nanoplástico de poliestireno (PS) se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión de luz dinámica (DLS). Como se muestra en la Fig. 1a, b y la Fig. 1 complementaria, las perlas de PS se monodispersaron y asumieron un tamaño promedio de 21,2 ± 3,5 nm en agua y 26,2 ± 4,6 nm en medio de células endoteliales (ECM) como lo indica TEM. En comparación, el nanoplástico PS mostró un tamaño hidrodinámico de 62 ± 5,0 nm en H2O y 72 ± 2,0 nm en ECM según lo determinado por DLS, debido a cierto grado de aglomeración. En consecuencia, el potencial ζ del nanoplástico cambió de −35,4 ± 1,9 mV en H2O a −7,5 ± 0,5 mV en ECM (Tabla complementaria 1). Además, el análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) indicó la presencia de carboxilos en el nanoplástico (Fig. 1c). La toxicidad del nanoplástico se cuantificó aún más mediante un kit de conteo de células 8 in vitro (CCK 8), especies reactivas de oxígeno (ROS) y ensayos de mortalidad celular, donde las HUVEC se expusieron a diferentes concentraciones del nanoplástico a lo largo del tiempo (Fig. 1d, e y Fig. 2 complementaria). Las HUVEC con integridad de ADN y/o membranas comprometidas se indicaron mediante tinción con yoduro de propidio (PI) con un tratamiento de 22 h (Fig. 1d y Fig. 2a complementaria), y no se produjo una muerte celular obvia para la incubación hasta 10 h para todas las concentraciones de nanoplásticos. aplicado. La contracción y la deformación de las células se produjeron con nanoplásticos de PS de 0,5 mg/ml después de 22 h, mientras que no se observaron cambios significativos ni en la viabilidad celular ni en el daño de la membrana con concentraciones de PS de 0,05 a 0,25 mg/ml. Para períodos más cortos de tratamiento, la viabilidad celular no se vio afectada por el nanoplástico PS a 0,05 y 0,5 mg/mL dentro de 1 h de exposición (Fig. 1e); sin embargo, la producción de ROS se correlacionó positivamente con la concentración y el tiempo del nanoplástico. Específicamente, se observaron ROS en concentraciones bajas de nanoplásticos (0,05 y 0,1 mg/mL) durante 1 h (Fig. 2b, c complementarias). La internalización de nanoplásticos de PS en HUVEC se mejoró con un mayor tiempo de incubación y dosis (Fig. 1f y Fig. 3 complementaria). Además, estudiamos la forma en que el nanoplástico PS incitaba a la muerte celular. La autofagia es un proceso de autodigestión18 implicado tanto en la muerte como en la supervivencia celular19. Se ha demostrado que la forma lipidada de la cadena ligera 3 de la proteína asociada a los microtúbulos (LC3), LC3-II, es un marcador de autofagosoma, y ​​la tasa de formación o recambio de LC3-II se utiliza como indicador de la actividad de autofagia20. Encontramos que 0.05 mg/mL de nanoplástico PS no aumentó la conversión de LC3-II en HUVEC a 1 y 3 h, pero regulaba significativamente el nivel de expresión de LC3-II a las 6 h. Además, se pudo detectar una expresión abundante de LC3-II en solo 1 h en presencia de 0, 5 mg / ml de nanoplástico PS (Fig. 1g). Además, el nanoplástico PS indujo autofagia y apoptosis al inhibir la vía PI3K/AKT en HUVEC a las 6 h (Figs. 4 y 5 complementarias). Específicamente, las transferencias Western mostraron que las proteínas relacionadas con la autofagia Beclin1, p62 y Atg5 y la proteína proapoptótica Bax aumentaron significativamente, mientras que la proteína antiapoptótica Bcl-2 disminuyó significativamente en HUVEC de manera dependiente de la dosis. Los resultados de la expresión génica y la expresión de proteínas coincidieron (Figuras complementarias 4 y 5). Cuando las HUVEC se expusieron a 0,05 o 0,5 mg/mL de nanoplástico PS durante 6 h, se observaron núcleos atróficos y formación de cuerpos apoptóticos (Fig. 6 complementaria).

a, b Imágenes TEM de nanoplásticos de poliestireno (PS) en agua Milli-Q y su distribución de tamaño correspondiente (n = 341 nanopartículas examinadas). Barra de escala: 50 nm. c Los grupos funcionales de nanoplástico PS se determinaron mediante análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS). El pico dominante en 284,83 eV surgió del enlace C-C, y los otros picos en 286,34 eV y 289,28 eV se atribuyeron al enlace C-O y O=C-O, respectivamente. d Toxicidades de HUVEC tras la exposición a diferentes concentraciones de nanoplástico PS a las 22 h. Las células muertas teñidas con PI se revelaron en el canal de fluorescencia rojo (n = 3 réplicas biológicas). Barras de escala: 200 μm. e La viabilidad celular con nanoplástico PS a 0,05 y 0,5 mg/ml se midió mediante un ensayo CCK8 en diferentes momentos (1, 3 y 6 h). Se usó H2O2 (200 μM) como control positivo. El análisis estadístico se realizó a través de un ANOVA de una vía seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Se insertaron en el panel los valores de p que comparaban con el control en cada grupo. f Evaluación de la asociación celular para diferentes concentraciones de nanoplástico PS a 1, 3 y 6 h. La fluorescencia verde del nanoplástico se midió mediante citometría de flujo. Los datos se expresan como media ± SD (n = 3). El análisis estadístico se realizó a través de un ANOVA de dos vías seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados se insertaron en el panel. g Western blot y análisis semicuantitativo del nivel de expresión de la cadena ligera 3-II/I (LC3-II/I) de la proteína asociada a microtúbulos. Las HUVEC se expusieron a nanoplástico PS (0,05 y 0,5 mg/mL) durante diferentes tiempos (1, 3 y 6 h). Como control positivo se utilizó rapamicina (1 μM) con 6 h de tratamiento. Los niveles de proteína se estandarizaron en comparación con la β-actina. Los datos se expresan como media ± SD. Se utilizaron muestras biológicamente independientes (n = 3). El análisis estadístico se realizó a través de ANOVA de dos vías seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados se insertaron en el panel. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las nanopartículas inorgánicas aniónicas pueden migrar y alterar las uniones adherentes entre las células endoteliales para inducir NanoEL21. Curiosamente, observamos NanoEL en HUVEC en presencia de nanoplástico PS polimérico. Postulamos que el nanoplástico podría interrumpir las uniones adherentes y causar más fugas endoteliales (Fig. 2a). Para confirmar la aparición de fugas endoteliales, realizamos un ensayo Transwell con una sonda fluorescente, dextrano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano), con una monocapa de HUVEC intacta expuesta a varias concentraciones de nanoplástico PS (Fig. 2b). Se observó una fuga significativa cuando las células se trataron con 0,5 mg/mL del nanoplástico dentro de la hora de exposición. A medida que el tratamiento aumentó a 6 h, observamos la aparición de fugas endoteliales para todas las concentraciones del nanoplástico. Luego empleamos tinción de inmunofluorescencia para visualizar la interrupción de las uniones adherentes en las barreras endoteliales, donde se aplicaron dos concentraciones representativas de nanoplástico PS a 0,05 y 0,5 mg/mL a HUVEC, y se usaron 0,5 mM de EDTA como control positivo (Fig. 2c, Figuras complementarias 7 y 8). Se observaron abundantes lagunas para 0,05 y 0,5 mg/mL del nanoplástico a las 6 h. Los cambios morfológicos y la interrupción de la integridad de la cadherina VE en HUVEC se notaron a las 3 y 6 h en comparación con el control. El grado de fuga endotelial se determinó mediante un análisis de área de brecha utilizando ImageJ (Fig. 2d y Fig. 7 complementaria)21. Los porcentajes derivados de áreas de brecha corroboraron los datos del ensayo Transwell, donde la fuga endotelial fue más pronunciada con el tiempo para nanoplásticos PS de 0,05 y 0,5 mg/mL. El grado de filtración endotelial a las 6 h reveló una elevación notable, en comparación con las incubaciones de 1 h y 3 h. Al mismo tiempo, la alteración de la intensidad de la fluorescencia de los filamentos de actina indicó una reorganización de la red de actina del citoesqueleto, junto con el fenómeno de fugas endoteliales, a las 3 y 6 h de exposición del nanoplástico a 0,05 mg/ml y a las 1, 3, 6 h de exposición del nanoplástico. a 0,5 mg/mL, respectivamente (Fig. 2e). Además, se implementó un ensayo desplegable de proteína VE-cadherina para investigar si el nanoplástico PS podría unirse directamente y alterar las uniones adherentes. Después de la exposición a diferentes concentraciones de nanoplástico PS y durante diferentes duraciones, se lisaron las células enteras y el nanoplástico PS con sus proteínas asociadas en los medios de cultivo se centrifugaron al mismo tiempo. Como se muestra en la Fig. 2f y la Fig. 9 complementaria, la cadherina VE homófila de las uniones adherentes fue derribada por el nanoplástico PS de una manera dependiente de la dosis, y se observó una elevación de las cadherinas VE unidas a PS a 0,5 mg/ mL de 0,05 mg/mL, mientras que la duración de la exposición no influyó en la cantidad de cadherinas VE absorbidas por el nanoplástico PS. Además, se añadieron nanoplásticos de PS de 0,05 y 0,5 mg/ml a un lisado celular no tratado (postlisis, P), que no eliminó ninguna cadherina VE detectable. La interpretación del resultado específico mostró que el nanoplástico PS se unía a las cadherinas VE dentro de las uniones adherentes y no en la condición de tampón de lisis, lo que sugiere que era necesaria una unión adherente intacta para que el nanoplástico PS se uniera a la cadherina VE. Por otro lado, no hubo cadherinas VE desplegables en presencia de perlas magnéticas de proteína A/G (A) después de la lisis celular sin nanoplástico PS. El lisado de células enteras mostró una expresión similar de cadherina VE en los diversos grupos, lo que indica que el nanoplástico PS no afectó la expresión de cadherina VE celular transcripcional o postraduccionalmente.

a Interacción ilustrada entre uniones adherentes y nanoplásticos de poliestireno (PS). La integridad de la monocapa de HUVEC se vio interrumpida por el nanoplástico PS debido a su interacción con la cadherina VE. b El ensayo Transwell indicó una dependencia de la dosis y el tiempo en la permeabilidad de las barreras de células endoteliales. Los datos se expresan como media ± DE (n = 3 muestras biológicamente independientes). El análisis estadístico se realizó a través de ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados comparados con el control en cada grupo se insertaron en el panel. c La microscopía de fluorescencia confocal observó fugas endoteliales en presencia de diferentes concentraciones de nanoplástico PS (0,05 y 0,5 mg/mL) tras 1, 3 y 6 h de exposición (n = 3 réplicas biológicas). Las cadherinas VE se tiñeron de color rojo. Las flechas blancas indican brechas inducidas por PS entre HUVEC. Barra de escala: 20 μm. d El análisis semicuantitativo del área de los espacios se realizó mediante el software ImageJ de acuerdo con las imágenes del panel c. Los datos se expresan como media ± SD (n = 3 experimentos biológicamente independientes). El análisis estadístico se realizó a través de ANOVA de dos vías seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados en comparación con el control se insertaron en el panel. e La intensidad de la actina se analizó mediante el software ImageJ correspondiente a las imágenes en la Fig. 7 complementaria. Los filamentos de actina se tiñeron con faloidina-iFluor 488. Los datos se expresan como medias ± SD (n = 3 experimentos biológicamente independientes). El análisis estadístico se realizó a través de ANOVA de dos vías seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados en comparación con el control se insertaron en el panel. f El PS se une directamente a las cadherinas VE homofílicas de la unión adherente (VEC) de una manera dependiente de la dosis. Después de la lisis (P), la adición de PS a 0,05 y 0,5 mg/ml a un control no tratado no eliminó ninguna cadherina VE detectable. Se agregaron perlas magnéticas de proteína A/G (A) para mostrar que no se precipitaron cadherinas VE detectables sin la adición de PS (n = 3 experimentos biológicamente independientes). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. (Algunos elementos de arte en el panel a son de smart.servier.com.).

Además del nanoplástico PS carboxilado como se describió anteriormente, también empleamos otros dos tipos de nanoplásticos, a saber, poliestireno aminado (NH2-PS) y poli(metacrilato de metilo) (PMMA), para explorar la competencia NanoEL de los nanoplásticos de diferente carga y química. composición.

De manera similar, los nanoplásticos NH2-PS y PMMA se caracterizaron mediante TEM, DLS y XPS. En particular, TEM reveló el tamaño promedio de NH2-PS y PMMA como 19.7 ± 3.8 nm y 54.7 ± 6.1 nm, respectivamente (Fig. 3a, Figs. Complementarias 10 y 11), mientras que las mediciones DLS indicaron dos picos del tamaño hidrodinámico de 31 ± 0,6 nm y 3984 ± 253,4 nm para nanoplástico NH2-PS y 89 ± 1,3 nm para nanoplástico PMMA en H2O (Tabla complementaria 1). Además, las mediciones del potencial ζ revelaron una carga superficial positiva de 31,0 ± 1,3 mV para el nanoplástico NH2-PS y una carga superficial negativa de −24,8 ± 0,7 mV para el PMMA (Tabla complementaria 1). El tamaño y el potencial ζ de los nanoplásticos también se probaron en ECM mediante DLS, que no mostró cambios significativos. Las caracterizaciones superficiales de ambos nanoplásticos se analizaron más con XPS, lo que reveló la presencia de amidógenos en el nanoplástico NH2-PS y carboxilos en el nanoplástico PMMA como se esperaba (Fig. 3b).

una imagen TEM de nanoplásticos NH2-PS y PMMA en H2O (n = 3 muestras independientes). b Los grupos funcionales de nanoplásticos NH2-PS y PMMA se determinaron mediante análisis XPS. Los principales picos de NH2-PS a 402,06 y 400,02 eV se relacionaron con los enlaces C–N y N–H, respectivamente. El pico dominante de PMMA a 284,74 eV surgió del enlace C-C o C=C, y los picos a 286,33 eV y 288,57 eV se pueden atribuir al enlace C-O y O=C-OH, respectivamente. c, d Viabilidad celular de NH2-PS y nanoplásticos de PMMA a 0,05 y 0,5 mg/ml, medida mediante un ensayo CCK8 en diferentes momentos (1, 3 y 6 h). Se usó H2O2 (200 μM) como control positivo. Los datos se expresan como media ± SD (n = 3 experimentos biológicamente independientes). El análisis estadístico se realizó a través de ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados en comparación con el control se insertaron en el panel. e, f El ensayo de Transwell indicó que el nanoplástico de NH2-PS con carga positiva era incapaz de inducir fugas endoteliales, mientras que el nanoplástico de PMMA con carga negativa desencadenó la fuga de las barreras de células endoteliales. Los datos se expresan como media ± SD (n = 3 experimentos biológicamente independientes). El análisis estadístico se realizó a través de ANOVA de dos vías seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados en comparación con el control se insertaron en el panel. g La microscopía de fluorescencia confocal reveló fugas endoteliales en presencia de nanoplásticos de PMMA (0,05 y 0,5 mg/mL) en tratamientos de 1, 3 y 6 h (n = 3 experimentos biológicamente independientes). Las flechas blancas indican brechas entre HUVEC. Si bien no se observó fuga endotelial en el tratamiento con nanoplásticos NH2-PS. Barra de escala: 20 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además, expusimos HUVEC a ambos tipos de nanoplásticos para diferentes concentraciones y duraciones de tratamiento. En particular, 1 h de exposición de HUVEC al nanoplástico NH2-PS a 0,05 mg/mL no afectó la viabilidad celular, mientras que la mortalidad celular aumentó significativamente con el aumento de la dosis y el tiempo de incubación del nanoplástico (Fig. 3c). En comparación, el nanoplástico de PMMA con carga negativa mostró una mejor biocompatibilidad e inocuidad (Fig. 3d). Además, para observar la interrupción de las uniones de cadherina VE y cuantificar NanoEL provocado por los nanoplásticos, se empleó la tinción de inmunofluorescencia de cadherinas VE y se midió la permeabilidad de la monocapa endotelial de HUVEC mediante un ensayo transwell (Fig. 3e-g y Fig. 12 complementaria) . Específicamente, el nanoplástico de PMMA ya exhibió la capacidad de inducir NanoEL a la baja concentración de 0,05 mg/mL en 1 h, que se hizo más pronunciada con el aumento de la concentración de nanoplástico y el tiempo de exposición. Como era de esperar, el nanoplástico NH2-PS ejerció poco impacto en la fuga endotelial. En general, estos resultados indicaron que NanoEL podría ser activado por nanoplásticos cargados negativamente de 20 a 60 nm de tamaño, tanto para PS como para PMMA.

La producción de ROS es un sello distintivo de la citotoxicidad22. Muchas nanopartículas de óxido de metal pueden inducir ROS23 celular, lo que indirectamente conduce a fugas endoteliales a través del daño del citoesqueleto24. Por otro lado, la captación celular no es necesaria para la ocurrencia de la fuga21. Entre los biomarcadores relevantes, 4-amino-5-(4-metilfenil)-7-(t-butil)pirazolo[3,4-d]-pirimidina (PP1) es un inhibidor de la quinasa Src que inhibe la fosforilación de cadherina VE25, rho El inhibidor Y-27632 de la proteína quinasa asociada (ROCK) previene la perturbación de la red citoesquelética26, y la N-acetil-L-cisteína (NAC) inhibe la generación de ROS. Descubrimos que los inhibidores de endocitosis metil-β-ciclodextrina (MβCD) y monodansilcadaverina (MDC) no pudieron prevenir la fuga inducida por el nanoplástico PS, mientras que PP1 e Y-27632 podrían detener el proceso (Fig. 4a). Observamos un aumento significativo en el nivel de ROS después de que las HUVEC se trataron con nanoplástico PS durante 1 h (Fig. 2 complementaria). No hubo una diferencia significativa en el nivel de fugas cuando las células se trataron con el antioxidante NAC (5 mM) o los inhibidores de endocitosis MβCD (5 mM) y MDC (10 µM) durante 1 h antes de la exposición al nanoplástico (0,05 mg/ml) durante 1 h (Fig. 4b). Sin embargo, en comparación con el grupo PS, los niveles de fugas en el grupo PP1 y el grupo Y-27632 se redujeron significativamente (P < 0,05 o P < 0,001). Se obtuvieron resultados consistentes al tratar las células con 0,5 mg/mL de nanoplástico PS (Fig. 4c). El fenómeno anterior indicó que la fuga endotelial inducida por nanoplásticos de PS era independiente de la formación de ROS y la endocitosis, pero estaba relacionada con la vía de cadherina VE y la remodelación de actina.

a El bloqueo de la endocitosis con inhibidores o la inhibición de ROS no evitó la fuga del nanoplástico PS. Sin embargo, el inhibidor de la quinasa Src PP1 y el inhibidor de ROCK Y-27632 afectaron la fuga del nanoplástico PS. Las HUVEC se trataron con inhibidor de quinasa Src PP1 (10 µM), inhibidor de proteína quinasa asociada a rho (ROCK) Y-27632 (10 µM), inhibidores de endocitosis (metil-β-ciclodextrina 5 mM (MβCD) y monodansilcadaverina (MDC) 10 µM) ), o inhibidor de ROS (N-acetil-L-cisteína (NAC) 5 mM) durante 1 h antes del tratamiento con b 0,05 mg/ml o c 0,5 mg/ml de nanoplástico PS. PP1 e Y-27632 redujeron significativamente la penetración de FITC-dextrano en comparación con sus homólogos respectivos sin tratamientos con inhibidores. MβCD, MDC o NAC no redujeron significativamente el grado de penetración de FITC-dextrano en comparación con sus equivalentes respectivos sin tratamientos con inhibidores. Los datos se expresan como media ± SD. Se utilizaron muestras biológicamente independientes (n = 3). El análisis estadístico se realizó a través de ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados se insertaron en el panel. Análisis de transferencia Western de cadherina VE y sus niveles de fosforilación: d 0,05 mg/ml o e 0,5 mg/ml El tratamiento con nanoplásticos PS indujo la fosforilación de tirosina de cadherina VE en Y658 y Y731. Sin embargo, PP1 inhibió efectivamente la fosforilación de cadherina VE inducida por nanoplásticos de PS en Y658 y Y731. f El análisis semicuantitativo reveló la activación de la señalización de cadherina VE (VEC) expuesta a nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/ml). Los datos se expresan como media ± SD (n = 3 experimentos biológicamente independientes). El análisis estadístico se realizó a través de ANOVA de dos vías seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados se insertaron en el panel. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El estado natural de las células endoteliales en los vasos sanguíneos maduros es una monocapa fusionada y estática, en la que las cadherinas VE se acumulan en los contactos entre las células y se adhieren a los tejidos correspondientes27. La cadherina VE contribuye al reordenamiento del citoesqueleto28 y a la remodelación de las uniones estrechas29 en las células endoteliales durante la angiogénesis. Aunque tiene otras funciones, la función principal de la cadherina VE es promover la adhesión entre las células endoteliales y aumentar la permeabilidad celular cuando se rompen las uniones27. La tirosina quinasa Src activa la fosforilación de VE-cadherina en los residuos Y658 e Y73130. VE-cadherina interactúa con p120 y β-catenina a través de su cola citoplasmática para promover la adhesión celular31. La fosforilación de tirosina de la cola citoplásmica de la cadherina VE interrumpe la unión de p120 y desestabiliza la interacción entre la cadherina VE y la catenina citoplasmática, formando así brechas a través del desplazamiento lateral de la cadherina VE fosforilada32. Usamos PP1 para detectar si el nanoplástico PS activaba la quinasa Src para inducir la fosforilación de cadherina VE. Para las HUVEC tratadas con nanoplástico PS de 0,05 o 0,5 mg/ml, PP1 impidió la fosforilación de cadherina VE en los residuos Y658 e Y731 (Fig. 4d, e). Hubo disminuciones significativas en los niveles de fosforilación de los residuos Y658 y Y731 de la cadherina VE cuando las células se trataron con PP1 (10 µM) durante 1 h antes de la introducción del nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/ml) varias veces (1 , 3 o 6 h) (Fig. 4f). Nuestros datos mostraron además que el nanoplástico PS puede desencadenar la fosforilación de cadherina VE, lo que puede aumentar las brechas intercelulares e inducir fugas. Además, encontramos que PMMA (0, 05 o 0, 5 mg / ml) también indujo la fosforilación de cadherinas VE (Fig. 13 complementaria).

Para caracterizar la interrupción del dímero de cadherina VE inducida por el nanoplástico PS, realizamos simulaciones de dinámica molecular discreta (DMD) de todos los átomos con modelos de solventes implícitos. Antes de ejercer una fuerza de tracción in silico, primero se realizó la simulación de unión de un dímero de cadherina con nanoplástico PS. Empleamos el primer dímero de dominio extracelular (EC1) de cadherina VE de longitud completa, ya que la región de intercambio de dominio en el dímero EC1 es importante para la adhesión trans de célula a célula21 (Fig. 5a). A continuación, se construyeron nanoplásticos PS con grupos de superficie carboxilo para investigar su competencia con NanoEL. Debido al alto costo computacional relacionado con el gran tamaño de PS, modelamos nanoplásticos de PS compuestos por 20 cadenas de PS repetitivas y el diámetro del nanoplástico formado fue equivalente a ∼15 Å para la simulación DMD de equilibrio de 50 ns (Fig. 5b). Se ha demostrado, tanto computacional como experimentalmente, que las cadenas de PS no cargadas de tamaños similares interactúan directamente con las células y penetran las membranas plasmáticas33,34. Aquí, PS modificado con carga negativa con grupos carboxilo se modeló como en los experimentos para minimizar sus interacciones directas con las membranas celulares que contienen lípidos cargados negativamente. Posteriormente, el nanoplástico construido se ubicó aleatoriamente a partir del dímero EC1 y se llevaron a cabo 30 simulaciones de unión independientes para identificar los sitios de unión del nanoplástico PS con el dímero de cadherina EC1. La frecuencia de unión calculada indicó que, después de 50 ns, el nanoplástico PS se unió fuertemente a los residuos 32–38, 42, 46–51 y 76–81 en el dímero de cadherina VE (Figura complementaria 14a). Estas regiones estaban ubicadas lejos de la región interfacial del dímero y eran ricas en residuos cargados positivamente, como lo indica la representación de la superficie del dímero codificado por colores según las frecuencias de unión de nanoplásticos (Fig. 5c). Los datos de frecuencia de unión sugirieron que el nanoplástico PS prefería unirse cerca de la región de giro del dímero. La cadena de PS no modificada, por otro lado, se unió a la interfaz del dímero (residuos 1–4, 85–89) debido a interacciones hidrofóbicas (Figuras complementarias 15a, b). Por lo tanto, las interacciones electrostáticas entre los grupos carboxilo en la superficie del nanoplástico PS y los residuos con carga positiva en la región de giro del dímero condujeron a la asociación de las dos entidades.

a Estructura del dímero de cadherina EC1. Los palos rojos y las esferas grises indican la región de intercambio de dominios y los iones de calcio, respectivamente. b Estructura de un nanoplástico PS carboxilado después de una simulación DMD de equilibrio de 50 ns. c Frecuencia de unión codificada por colores del nanoplástico PS en la superficie del dímero de cadherina EC1. Los colores azul y rojo representan frecuencias de unión bajas a altas. El panel ampliado detalla la unión de nanoplásticos con el dímero EC1. d Gráficos de violín de la unión del dímero con el nanoplástico PS. e Trayectorias de disociación representativas del dímero en presencia del nanoplástico PS bajo 0 pN de tracción.

Además de la simulación de unión, llevamos a cabo una simulación DMD dirigida (sDMD) para determinar los efectos del nanoplástico PS en la estabilidad del dímero de cadherina, así como en la disociación de cadherina. Aquí, consideramos un rango de fuerza bajo (0–20 pN), que fue suficiente para romper el dímero EC1 con nanopartículas de oro21, para medir la estabilidad del dímero de cadherina. Inmovilizamos uno de los dominios EC1 y aplicamos una fuerza constante al otro dominio EC1 con la dirección apuntando hacia el dominio EC2 asociado (Fig. 14b complementaria). Para cada caso de fuerzas aplicadas, se realizaron 30 simulaciones sDMD independientes con velocidades inicialmente aleatorias durante 100 ns. Para las simulaciones de sDMD, calculamos el primer tiempo medio de disociación del dímero de cadherina cuando el número de contactos atómicos entre el dímero de cadherina se redujo a cero. Se obtuvo un diagrama de violín en función del tiempo de disociación y las fuerzas constantes aplicadas (Fig. 5d). Descubrimos que el nanoplástico PS inducía altas probabilidades de disociación temprana del dímero EC1 en comparación con el control de cadherinas sin nanoplástico PS. Se observaron altas probabilidades de tiempos de disociación cortos a medida que aumentaba la magnitud de las fuerzas aplicadas. Las trayectorias representativas revelaron que el nanoplástico unido causó una disociación temprana del dímero de cadherina (Fig. 5e). Por el contrario, la unión de la cadena de PS no modificada a la interfaz del dímero no desestabilizó el dímero (Fig. 15c complementaria). Para confirmar la estabilidad reducida del dímero de cadherina inducida por el nanoplástico PS, calculamos además la distribución del ángulo del dímero y la fluctuación cuadrática media (RMSF) de los dominios flexibles del dímero durante los primeros 30 ns de la simulación sin fuerzas aplicadas (Suplementario Fig. 14c, e). Anteriormente descubrimos que las nanopartículas de oro inorgánicas cambiaron el dímero EC1 de estados estables (dímero s) a estados intermedios (dímero x) mientras reducían la entropía del dímero de cadherina para interrumpir su función inherente21. En el presente trabajo, nuestros resultados computacionales sugirieron que la unión del nanoplástico PS desestabilizó el dímero de cadherina a través de un mecanismo molecular similar al alterar el estado del dímero de dímero s a dímero x y reducir la flexibilidad del dímero.

Además de PS, también investigamos cómo el nanoplástico PMMA podría inducir la alteración del dímero de cadherina. Se descubrió que el PMMA de 20 mer con carga negativa modificado mediante la eliminación de grupos metilo de un subconjunto de repeticiones compuestas formaba un glóbulo compacto después de simulaciones DMD de equilibrio de 50 ns (Fig. 16a complementaria). Calculamos la frecuencia de unión de PMMA con el dímero de cadherina a través de simulaciones de DMD de unión de 50 ns. El nanoplástico de PMMA tenía una unión fuerte similar a las mismas regiones de giro en la cadherina que los nanoplásticos de PS (Fig. 5a), pero también una unión débil a las regiones de interfaz del dímero (Fig. 16b, c complementarias). Las simulaciones posteriores de sDMD del dímero de cadherina con nanoplástico de PMMA indicaron que el nanoplástico de PMMA también aumentó la disociación del dímero de cadherina bajo fuerzas bajas (Fig. 16d complementaria). Curiosamente, debido a la unión adicional de PMMA a la interfaz del dímero de cadherina, se observó una vía de disociación alternativa con unión competitiva del nanoplástico a uno de los monómeros de cadherina (Fig. 16e complementaria). Independientemente de su composición química, tanto el PS aniónico como los nanoplásticos de PMMA indujeron la disociación del dímero de cadherina. Aunque los tamaños de los nanoplásticos de PS y PMMA no eran directamente comparables con los de los experimentos, debido a la necesidad de reducir los costos computacionales, nuestras simulaciones adicionales mostraron que una gama de nanoplásticos de PS con un tamaño aumentado de hasta 80 mer interrumpía constantemente la cadherina. dímero (Fig. 5e y Fig. 17 complementaria). Por lo tanto, se espera que los nanoplásticos grandes se comporten de manera similar al interactuar con el dímero de cadherina VE. En conjunto, nuestros datos in silico corroboraron las observaciones experimentales de que los nanoplásticos de PS y PMMA eran competentes para interrumpir la asociación cadherina-cadherina y nuestras simulaciones revelaron además que la unión de nanoplásticos redujo la estabilidad del dímero de cadherina a través de una mayor tensión entre dominios y una entropía reducida.

Además de los exámenes in vitro e in silico, también realizamos ensayos ex vivo utilizando vasos de conejo y cerdo para medir la fuga en estos endotelios vasculares inducidos por nanoplástico PS (Fig. 6a). Se observó que las intensidades de fluorescencia de EBD filtrado en vasos de conejo se elevaron con el aumento de la concentración de nanoplástico PS (Fig. 6b). Observamos un fenómeno similar con los buques porcinos (Fig. 6c). Cuando los vasos porcinos se trataron con 0,5 y 5 mg/ml de nanoplástico PS durante 6 h, la fuga de los vasos porcinos mejoró significativamente en comparación con el control (P < 0,001). Al mismo tiempo, también detectamos la fosforilación de cadherinas VE ex vivo (Fig. 18 complementaria).

un esquema de la construcción ex vivo. b Aumento dependiente de la concentración en la penetración del colorante azul de Evans (EBD) en vasos de conejo. Las cuantificaciones de EBD indicaron que los grupos nanoplásticos de poliestireno (PS) de 0,05 y 0,5 mg/ml eran significativamente diferentes del control no tratado. El nanoplástico PS de 0,5 mg/mL indujo más fugas que el grupo de nanoplástico PS de 0,05 mg/mL. Los datos se expresan como media ± SD. Se utilizaron muestras biológicamente independientes (n = 3). El análisis estadístico se realizó a través de ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados en comparación con el control se insertaron en el panel. c Aumento dependiente de la concentración de la penetración de EBD en buques porcinos. La penetración de EBD fue más pronunciada en el grupo de nanoplásticos de PS de 5 mg/ml que en el grupo de nanoplásticos de PS de 0,5 mg/ml. Los datos se presentan como medias ± DE (n = 3 muestras biológicamente independientes), analizados mediante ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparación múltiple de Tukey. Los valores de P derivados en comparación con el control se insertaron en el panel. d Los ratones Swiss macho recibieron una inyección intravenosa de nanoplástico PS (1,5, 15 o 30 mg/kg) que contenía una solución de EBD 10 mM. Los ratones de control recibieron una inyección intravenosa de EBD 10 mM. Después de 24 h, los ratones se sacrificaron para recolectar sus órganos para obtener imágenes. La señal de fluorescencia aumentó gradualmente de amarillo a rojo con una mayor dosis de nanoplástico. Cuanto mayor era la fuga de EBD, más fuerte era la señal de fluorescencia. El nanoplástico PS promovió la fuga de los vasos sanguíneos subcutáneos en ratones. Se inyectaron nanoplásticos PS (30 mg/kg) en bolsillos subcutáneos en la espalda de los ratones. EBD se inyectó mediante inyección intravenosa en la cola. La cuantificación de EBD mostró más fugas endoteliales en el grupo de PS en comparación con el grupo de ratones no tratados. Los datos se expresan como medias ± SD (n = 3 animales biológicamente independientes), analizados mediante la prueba t de Student de dos colas. Los valores de P derivados en comparación con el control se insertaron en el panel. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. (Algunos elementos de arte en el panel a son de smart.servier.com.).

Estudiamos más a fondo la fuga endotelial inducida por nanoplástico PS in vivo. Para los estudios que utilizan la administración intravenosa de nanopartículas, las nanopartículas se acumulan principalmente en el hígado y el bazo, etc.35,36. En nuestro experimento, los ratones fueron sometidos a una inyección intravenosa de una solución de EBD que contenía nanoplástico PS. Después de 24 h, observamos que, para el nanoplástico PS en dosis de 1,5 mg/kg, 15 mg/kg y 30 mg/kg, la permeabilidad de EBD existía principalmente en el cerebro, el hígado, el bazo y los pulmones de los ratones ( Figura 6d). También hubo una pequeña cantidad de fluorescencia de EBD filtrado en los riñones y diafragmas. Analizamos cuantitativamente las intensidades de fluorescencia del EBD filtrado en los tejidos. Excepto en el corazón, las intensidades de fluorescencia del EBD filtrado en el cerebro, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones y los diafragmas aumentaron significativamente con la introducción del nanoplástico PS (Figura complementaria 19). Las células endoteliales proporcionan una barrera física entre la circulación y el tejido subyacente. Sin embargo, ciertos estímulos pueden causar una ruptura parcial de la barrera endotelial, lo que aumenta la extravasación de líquido de la circulación al intersticio por encima de los niveles basales37. El aumento a largo plazo de la permeabilidad puede destruir las uniones célula-célula, lo que a su vez da como resultado una alteración de la integridad vascular27. Para investigar si el nanoplástico PS podría causar fugas en los vasos sanguíneos subcutáneos, inyectamos EBD en las venas de la cola de los ratones, seguido de un tampón PBS de control del vehículo o nanoplástico PS inyectado en las bolsas subcutáneas. El nanoplástico PS provocó la extravasación de EBD en la vasculatura subcutánea según las cuantificaciones, lo que confirma la aparición de fugas endoteliales (Fig. 6e).

Comprender la carga ambiental, incluido el ciclo de vida y la huella de carbono de los plásticos fósiles, es un gran desafío que enfrenta el mundo actual. Este desafío viene impuesto por la presencia cada vez mayor de la producción de plásticos a escala industrial, junto con su degradación notablemente gradual en el entorno natural. De hecho, los posibles efectos adversos de los plásticos en la salud humana, ya sea a través de la exposición directa o la transferencia trófica en la ecosfera, siguen sin estar claros. Esto es especialmente cierto para los nanoplásticos, una forma final concebible de plásticos a través de las fuerzas del hombre y la naturaleza, cuyas implicaciones biológicas solo han comenzado a ser evidentes en los últimos años. En este estudio, documentamos nuestro descubrimiento de fugas endoteliales inducidas por poliestireno aniónico y nanoplásticos de PMMA, caracterizados por las técnicas de imágenes de fluorescencia confocal, ensayos transwell, vías de señalización con HUVCE, vasos de conejos y cerdos y ratones, así como microscopía de fuerza virtual. de simulaciones por ordenador. La fuga endotelial mostró una dependencia de la dosis y el tiempo sobre la exposición celular a ambos tipos de nanoplásticos, mediada por cambios conformacionales y estructurales en las uniones VE-cadherina de las células endoteliales comprometidas con las nanopartículas poliméricas e independientes de la producción de ROS, la autofagia y la apoptosis de las células impactadas. . Dado que la aparición de fugas endoteliales implica que los nanoplásticos podrían penetrar dentro y fuera de la vasculatura que se extiende por el cuerpo, este descubrimiento implica profundas implicaciones para comprender la seguridad y las huellas biológicas de los materiales plásticos sintéticos que pueblan el medio ambiente.

Todos los experimentos con animales cumplieron con las normas éticas para pruebas e investigaciones con animales de acuerdo con las pautas de los NIH y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad Southwest (referencia (número de ID) IACUC-20200525-01).

Para imágenes TEM de PS (perlas de PS carboxiladas de 30 nm, número de catálogo L5155, Sigma-Aldrich, EE. UU.), NH2-PS (perlas de PS aminadas de 30 nm, número de catálogo: PSGF00030, Zhongke Detong Inc, China) y PMMA (perlas de PS PMMA carboxilado, número de catálogo: BKPMMA50, Beikenami Inc, China) nanoplásticos, se dejaron caer 5 µL de las muestras en rejillas de cobre recubiertas de carbono/formvar descargadas luminiscentes (malla 400, ProSciTech). Después de 1 min de incubación, las rejillas se secaron y lavaron con 10 μl de Milli-Q H2O, luego se tiñeron negativamente con 5 μl de acetato de uranilo (UA, 1 %). Se tomaron imágenes de las muestras con un FEI Tecnai F20 operado a 200 kV. La distribución de tamaños se analizó mediante el software ImageJ 1.53c. Los diámetros hidrodinámicos de los nanoplásticos PS, NH2-PS y PMMA se determinaron mediante dispersión de luz dinámica (DLS) con Zetasizer Nano-ZS (Malvern) a temperatura ambiente. Las composiciones elementales de la superficie y el estado químico de los nanoplásticos se identificaron mediante espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS, Thermo escalab 250X, EE. UU.). Los nanoplásticos de PS, NH2-PS y PMMA se secaron por congelación en un secador por congelación (Alpha2-42DPlus, Christ). A continuación, la muestra de polvo se pegó a la plataforma de muestra con adhesivo conductor y luego se probó después de aspirar.

Se obtuvieron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, CRL-1730) de la American Type Culture Collection (ATCC, EE. UU.) y se cultivaron en medio de células endoteliales completo (ECM, ScienCell, EE. UU.) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS, Gibco, Estados Unidos). Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2 en el aire. Cuando las células alcanzaron la confluencia, se utilizó tripsina al 0,25 % para digerir las células durante 4 min. A continuación, se eliminó la tripsina y se introdujo en la mezcla un medio que contenía suero para detener la digestión. Las células se pipetearon, centrifugaron y resuspendieron en un nuevo medio.

Se sembraron aproximadamente 1 × 106 células/pocillo en placas de 6 pocillos durante la noche, seguido del tratamiento con nanoplástico PS o nanoplástico NH2-PS a 0,05 o 0,5 mg/ml durante 1, 3 o 6 h. A continuación, las células se lavaron con PBS y se analizaron utilizando una citometría de flujo BD FACS MelodyTM. Se adquirió un total de 1 × 104 eventos para cada muestra de tres experimentos independientes. Los datos fueron analizados por FlowJo_V10.

Se cultivaron aproximadamente 1 × 106 células/pocillo en placas de 6 pocillos y se expusieron al nanoplástico PS (0,05, 0,1, 0,25 y 0,5 mg/ml) durante 1, 3 o 6 h. Las células del grupo de control recibieron un tratamiento con medio sin suero durante 1, 3 o 6 h y luego se incubaron con el indicador DCFH-DA (Sigma-Aldrich, EE. UU.) en la oscuridad a 37 °C durante 30 min. Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La fluorescencia celular se analizó mediante un citómetro de flujo BD FACS MelodyTM. Los experimentos se repitieron 3 veces de forma independiente. Los datos fueron analizados por FlowJo_V10.

Se sembraron HUVEC (5 × 104 células/pocillo) en una placa negra de 96 pocillos con fondo transparente (Corning Costar, EE. UU.) y se cultivaron a 37 °C durante 48 h. Los medios antiguos se reemplazaron con ECM fresco que contenía yoduro de propidio 1 × 10−6 M (PI, Sigma-Aldrich, EE. UU.). Después de 30 min de incubación, las células se expusieron a diferentes concentraciones de nanoplástico PS (0, 0,05, 0,1, 0,25 y 0,5 mg/ml). Posteriormente, la morfología celular y el número de células muertas se midieron utilizando Operetta (objetivo PlanApo 20x, apertura numérica NA = 0,7, PerkinElmer) con una cámara de células vivas (37 °C, 5 % CO2) durante 22 h. La mortalidad celular se calculó por células positivas para PI a recuentos de células totales, que se derivaron de la función de mapeo de campo brillante del software de análisis e imágenes de alto contenido Harmony (PerkinElmer). Se sembraron HUVEC (5 × 103 células/pocillo) en una placa de 96 pocillos durante la noche antes del tratamiento con nanoplásticos PS, NH2-PS y PMMA (0,05 y 0,5 mg/ml) durante 1 h, 3 h y 6 h. El control negativo se expuso a medio fresco durante 1, 3 o 6 h. El control positivo se expuso a H2O2 200 μM durante 1, 3 o 6 h. Posteriormente, se agregó un volumen de 100 μL de medio y 10 μL de reactivo CCK8 a cada pozo y se incubó a 37 °C durante 2 h. La absorbancia de cada pocillo de cultivo se midió con un lector de microplacas (BioTek, EE. UU.) a la longitud de onda de 450 nm.

Se sembraron HUVEC a una concentración de 1 × 106 células/pocillo en placas de 6 pocillos (Dingjin, China). Para la vía de señalización de la autofagia, las células se trataron con nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/mL) durante diferentes tiempos (1, 3 o 6 h), el control negativo se expuso a medio fresco durante 1, 3 o 6 h. Para el tratamiento con nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/ml) durante 6 h, el control negativo se expuso a medio fresco durante 6 h. Para el ensayo de la vía de señalización de la apoptosis, las células se trataron con nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/ml) durante 6 h y el control negativo se expuso a medio fresco durante 6 h. Para el ensayo de la vía de señalización de cadherina-VE, las células se trataron con el inhibidor PP1 de la quinasa Src (10 µM) durante 1 h antes del tratamiento con nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/ml) durante 1, 3 o 6 h. Los grupos sin PP1 se expusieron a medio fresco con solo tratamiento con nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/ml) durante 1, 3 o 6 h. El control negativo se expuso a medio fresco. Para el ensayo de la vía de señalización de cadherina-VE, las células se trataron con nanoplástico de PMMA (0,05 o 0,5 mg/ml) durante 1, 3 o 6 h. Después de lavar 3 veces con PBS, las células se lisaron con tampón de lisis en hielo durante 10 min. Para el ensayo de la vía de señalización de cadherina-VE en modelos ex vivo, se homogeneizaron recipientes de conejo y cerdo a 4 °C y se centrifugaron a 10 000 g, 4 °C durante 20 min, y se recogieron los sobrenadantes. Las concentraciones de proteína de los lisados ​​​​celulares se determinaron utilizando el método de Carmassi Bradford. Las proteínas celulares de cada grupo se separaron mediante electroforesis estándar en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 8 % o al 12,5 % o al 15 % (SDS-PAGE) y luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (PALL, EE. UU.). Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente a temperatura ambiente durante 3 horas. Las membranas se lavaron con Tween 20 (Biofroxx, Alemania)/solución salina tamponada con Tris (TBST) y se incubaron con anticuerpo IgG anti-conejo de cabra biotinilado (H + L) o IgG anti-ratón de cabra biotinilado (H + L) (1: dilución 2000, Sangon, China) durante 1 hora y con anticuerpo de estreptavidina marcado con HRP (dilución 1:5000, Sangon, China) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas se visualizaron en el sistema de quimioluminiscencia electrogenerada (ECL). Se eligieron imágenes representativas de al menos tres experimentos independientes. Las imágenes de bandas de proteínas se analizaron de manera semicuantitativa a través del software ImageJ 1.53c. Los escaneos sin recortar de las manchas se proporcionaron en el archivo de datos de origen. Los anticuerpos primarios y secundarios se enumeraron en la Tabla complementaria 2.

Se sembraron HUVEC a una concentración de 1 × 106 células/pocillo en placas de 6 pocillos (Dingjin, China). Las células se trataron con nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/ml) durante 6 h. Luego, las células se lisaron y recolectaron para la extracción de ARN con un kit de purificación de ARN total (BioTeke, China). El ARN purificado se transcribió inversamente en ADNc con el kit de síntesis de ADNc de la primera cadena del transcriptor (Yeasen, China). A continuación, se analizó el ADNc mediante análisis RT-qPCR utilizando 2x SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake, EE. UU.) en una máquina de PCR en tiempo real (Roche, Suiza). Los datos de tres experimentos independientes se analizaron con β-actina como patrón interno. Los cebadores utilizados para la amplificación se enumeraron en la Tabla complementaria 3.

Las HUVEC se sembraron en placas confocales a una densidad de 8 × 104 células/pocillo y se cultivaron durante 24 h. Las células se trataron con nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/ml) durante 6 h. Luego, las células se tiñeron con DAPI (200 μL) durante 10 min. Después de lavar con PBS tres veces, las características morfológicas de las células se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia confocal (Nikon, N-SIM E).

Se sembraron HUVEC (5 × 105 células/pocillo) en portaobjetos de cámara de 8 pocillos y se cultivaron durante 5 a 6 días para formar una monocapa intacta. A continuación, se añadieron a los pocillos nanoplástico PS, NH2-PS y PMMA a 0,05 y 0,5 mg/ml en medio celular fresco y se incubaron con células durante 1, 3 o 6 h. Después de eso, las células se lavaron dos veces cuidadosamente con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, Sigma Aldrich, EE. UU.) y se fijaron con paraformaldehído al 4 % (PFA, Sigma Aldrich, EE. UU.) durante 15 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las células se bloquearon usando saponina al 0,1 % y suero de caballo al 5 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se utilizó inmunotinción para provocar la expresión de cadherinas VE y filamentos de actina. Se añadió anticuerpo anti-VE-cadherina policlonal de conejo a 1:400 en suero de caballo al 5 %/PBS en los pocillos de la cámara y se incubó durante la noche a 4 °C. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con una solución de anticuerpo secundario (Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594 a 1:500 en PBS que contenía 0,1 % de faloidina-iFluor 488) durante 2 h a temperatura ambiente. Luego se añadió a las células Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) a 1:2000 en PBS y se incubaron durante 5 min. Luego se tomaron imágenes de los portaobjetos de la cámara utilizando un microscopio de fluorescencia confocal (SP8 LIGHTNING, Leica Microsystems) con un objetivo de aceite de 63x. El análisis de imagen semicuantitativo para el área de brecha y la intensidad de actina se realizó utilizando el software ImageJ 1.53c.

Las HUVEC se sembraron en insertos transwell (membrana de policarbonato, diámetro de poro de 0,4 μm; Corning Costar, EE. UU.) con aproximadamente 8 × 104 células y se cultivaron durante 4 días para alcanzar una confluencia de ~100 % para formar una monocapa intacta. Luego, las células se trataron con nanoplástico PS (0,05, 0,1, 0,25 y 0,5 mg/mL), NH2-PS (0,05 y 0,5 mg/mL) o PMMA (0,05 y 0,5 mg/mL) durante 1, 3 o 6 h. Para el ensayo de inhibición farmacéutica, las células se trataron con los inhibidores correspondientes, inhibidor de endocitosis metil-β-ciclodextrina 5 mM (MβCD, Solarbio, China) o monodansilcadaverina 10 μM (MDC, Sigma Aldrich, EE. UU.), inhibidor de ROCK 10 μM Y-27632 (Yuanye , China), inhibidor de quinasa Src PP1 10 µM (Yuanye, China) o inhibidor de ROS N-acetil-L-cisteína 5 mM (NAC, Sigma Aldrich, EE. UU.) durante 1 h antes del nanoplástico PS (0,05 o 0,5 mg/ml) tratamiento durante 1 h. Los grupos sin los inhibidores se expusieron a medio fresco con solo nanoplástico PS durante 1 h. El control negativo se expuso a medio fresco durante 1 h. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces cuidadosamente con PBS. FITC-dextrano (peso molecular medio 40.000, Sigma-Aldrich, EE. UU.) de 100 μL con una concentración final de 1 mg/mL se añadió a cada pocillo y los medios del compartimento inferior se recogieron después de 30 min. Las intensidades de fluorescencia se midieron a excitación/emisión de 495 nm/519 nm con un lector de microplacas. La lectura del grupo de control negativo se utilizó para normalizar las lecturas de los otros grupos.

Las HUVEC se sembraron en una placa de 96 pocillos (fondo negro/transparente, Corning Costar, EE. UU.) con aproximadamente 5 × 104 células/pocillo y se incubaron a 37 °C durante 48 h. Luego, las células se trataron con nanoplástico PS (0,05, 0,1, 0,25 y 0,5 mg/mL) durante diferentes tiempos (1, 3 y 6 h). Las células del grupo de control recibieron tratamiento con medio sin suero durante diferentes tiempos (1, 3 y 6 h). La fluorescencia intracelular se midió utilizando Operetta (PerkinElmer, objetivo de microscopio PlanApo 20x, apertura numérica NA = 0,7).

Se trataron monocapas confluentes de HUVEC con nanoplástico PS (0,05 y 0,5 mg/mL) durante diferentes tiempos (1, 3 y 6 h). Luego, las proteínas se extrajeron con tampón de lisis. El nanoplástico de PS con sus proteínas asociadas se extrajo mediante centrifugación (10 000 g, 20 min, 4 °C). El nanoplástico de PS se lavó 3 veces con tampón RIPA y las proteínas asociadas se desnaturalizaron del nanoplástico de PS a 97 °C durante 10 min en el tampón de carga. Para el experimento desplegable posterior a la lisis, las HUVEC se lisaron y se añadieron con nanoplástico PS (0,05 y 0,5 mg/ml) o perlas magnéticas de proteína A/G (Bimake, EE. UU.). Luego, las mezclas se agitaron suavemente durante 1 hora a 4 °C. Posteriormente, las perlas magnéticas de nanoplástico PS o proteína A/G con sus proteínas asociadas se derribaron mediante centrifugación (10 000 g, 20 min, 4 °C) y se lavaron 3 veces con tampón RIPA. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE estándar al 8% y luego se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Luego, las membranas se probaron con anticuerpos contra cadherina VE (1: 1000; Abcam, EE. UU.) Y tubulina α (1: 2000; Proteintech, China).

La dinámica molecular discreta (DMD) de todos los átomos se ha utilizado ampliamente para estudios biomoleculares que incluyen plegamiento de proteínas, agregación de péptidos38,39,40, estructura y dinámica de proteínas41,42 e interacciones entre nanopartículas y proteínas21,43,44. DMD es una clase especial de dinámica molecular (MD) en la que el campo de fuerza se remodela como funciones de paso discretas a partir de simulaciones de MD convencionales45. Específicamente, el potencial interatómico de las simulaciones DMD en este estudio consistió en los términos enlazados (es decir, enlaces, ángulo de enlace y ángulo diédrico) y no enlazados (es decir, van der Waals, enlaces electrostáticos, de solvatación y de hidrógeno). . En términos no vinculados, CHARMM forcefield46 y la aproximación de Debye-Hückel se aplicaron a van der Waals y los términos electrostáticos, respectivamente. La solvatación en parámetros no enlazados fue empleada por el modelo de disolvente implícito EEF1 desarrollado por Lazaridis y Karplus47, y el enlace de hidrógeno fue modelado con el algoritmo similar a una reacción48.

La cadherina es una proteína dependiente de calcio, que es una de las principales proteínas para la adhesión de célula a célula. Se sabe que el dímero trans está formado por las proteínas cadherinas provenientes de dos células opuestas involucradas en la adhesión de célula a célula. Nos enfocamos en la interacción trans que se formó principalmente por la región de intercambio de dominio en los primeros dominios del dominio extracelular (EC1). Utilizamos el dímero de cadherina EC1 del modelo crio-EM del dímero de cadherina EC12 (PDB ID: 3PPE49). Para garantizar la estabilidad estructural del dímero EC1 nativo, la región de dominio intercambiado que incluye el N-terminal (es decir, los residuos 1–5) se restringió aplicando el potencial Gō respectivamente (Fig. 5a). Aquí, las restricciones de Gō se asignaron solo entre los átomos de Cβ de los residuos en contacto con una energía de contacto débil de 0,3 kcal/mol (∼0,5 kBT). La coordinación de Ca2+ de los bucles (es decir, los residuos Glu11, Asp62, Glu64, Asp96 y Asp99) se modelaron mediante restricciones unidas por pares entre los átomos de oxígeno coordinados. A continuación, construimos un nanoplástico de PS y PMMA con grupos de superficie carboxilo para cada uno. Se preparó una cadena de PS compuesta por 20 monómeros de estireno repetitivos, se relajó y se equilibró para simulaciones de DMD de 50 ns. Una vez que la cadena PS pura formó una partícula compacta, se agregaron grupos carboxilo a la cadena PS seguido de simulaciones DMD de 50 ns. El nanoplástico PMMA se modeló siguiendo el método del nanoplástico PS. Cadenas largas de PS y PMMA construidas con grupos carboxilo mantenidos como una estructura compacta con los grupos carboxilo expuestos (Fig. 5b y Fig. 16a complementaria). Posteriormente, el nanoplástico se distribuyó aleatoriamente cerca del dímero de cadherina EC1 al menos a 12 Å de distancia en una caja cúbica de 120 nm3 para realizar la simulación de unión. Durante las simulaciones, se restringió la columna vertebral del dímero EC1 y sus cadenas laterales interactuaron libremente con los nanoplásticos PS y PMMA. Para ejecutar simulaciones DMD, se emplearon 50 fs/paso de la unidad de tiempo de simulación y 1 kcal/mol de energía correspondiente y se mantuvo una temperatura de 300 K con el termostato de Anderson. Llevamos a cabo 30 simulaciones DMD independientes para 50 ns y simulaciones totales acumulativas de 1,5 μs. Después de las simulaciones de unión, se calcularon las frecuencias de unión de los nanoplásticos PS y PMMA con el dímero de cadherina EC1 a partir de los últimos 20 ns de las simulaciones. Se asignó una distancia de corte de 0,65 nm para obtener un contacto atomístico entre el dímero de cadherina EC1 y los nanoplásticos PS y PMMA para calcular su frecuencia de unión.

A continuación, se realizaron experimentos in silico de fuerza de tracción constante en complejos nanoplásticos de cadherina-PS y cadherina-PMMA para identificar la estabilidad del dímero de cadherina EC1-EC1 a través de simulaciones de dinámica molecular dirigida (sDMD). La técnica sDMD generalmente imita pinzas ópticas y microscopía de fuerza atómica (AFM) para caracterizar biomoléculas en función de una velocidad constante o una fuerza constante. El enfoque de simulación de sDMD ha caracterizado con éxito la unión proteína-ligando, los complejos proteína-nanopartícula21,50 y el despliegue de proteínas51.

Antes de las simulaciones sDMD, distribuimos iones de cloruro cerca del complejo nanoplástico de cadherina-PS para neutralizar las cargas y aleatorizar la velocidad inicial de todos los átomos del sistema. Posteriormente, inmovilizamos la columna vertebral de uno de los dímeros EC1 (excluyendo el fragmento de intercambio de dominio) y el resto del dominio era flexible (Fig. 5e). El dominio flexible del dímero de cadherina EC1 fue atraído por fuerzas constantes a lo largo de la dirección de EC1 a EC2, imitando la interacción trans del dímero de cadherina durante las simulaciones de sDMD. Los detalles de la ejecución de simulaciones sDMD son los mismos que los de las simulaciones DMD vinculantes. Aplicamos 10 pN como fuerza de intervalo dentro del rango de 0 a 20 pN. Para un muestreo suficiente, se realizaron 30 casos de simulaciones sDMD independientes cada una para 100 ns. Usamos pyMol (Schrödinger) para analizar las trayectorias de disociación del dímero de cadherina con y sin nanoplásticos.

Las diversas especies de cadherina tienen dos dímeros intermedios y de intercambio de dominio diferentes conocidos como dímero x y dímero s durante la dimerización. Se ha identificado que los ángulos de dímero de dímero x y dímero s de la estructura cristalina de las cadherinas son de ~0 y 90 grados entre sí21. Calculamos el ángulo del dímero EC1 sin la fuerza aplicada durante los primeros 30 ns de las simulaciones sDMD antes de que el dímero comenzara a disociarse. Se consideraron los productos punto de dos vectores entre los residuos 88 y 98 para el dímero s y el 92 y 99 para el dímero x de los dominios flexible e inmovilizado del dímero de cadherina EC1. El ángulo del dímero se calculó con MATLAB_R2017a y el análisis de datos correspondiente se realizó con Python, dinámica molecular visual (VMD) y Grace.

Se realizó un ensayo de fugas vasculares utilizando vasos de conejo y cerdo como insertos transwell. Se obtuvieron recipientes de tres cerdos blancos grandes machos de 8 meses de edad de un matadero local en Chongqing, China. Se obtuvieron recipientes de tres conejos machos de Nueva Zelanda de 4 meses de edad de Ensiweier Biotechnology Co, Ltd. (Chongqing, China). Los vasos de la arteria coronaria se cortaron transversalmente en piezas individuales y se colocaron en una cámara transwell comercial después de retirar sus membranas originales. Se agregaron nanoplásticos de PS de 0,5 y 5 mg/mL al dispositivo Transwell de recipiente para conejos o cerdos hecho a medida y luego se incubaron durante 3 o 6 h a 37 °C, respectivamente. Después de la exposición, la solución que contenía nanoplásticos de PS se descartó y luego se agregó EBD 100 mM (Macklin, China) a cada pocillo, se incubó durante otra hora. Finalmente, la señal de fluorescencia del compartimento inferior del transwell se cuantificó a 624 nm con un lector de microplacas. Las lecturas del grupo de control negativo se usaron para la normalización.

Se obtuvieron doce ratones suizos machos de 10 semanas de edad de Ensiweier Biotechnology Co, Ltd. (Chongqing, China). A los ratones suizos machos se les suministró acceso libre a comida y agua y se mantuvieron en una temperatura estándar y un ambiente húmedo con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los ratones recibieron una inyección intravenosa de nanoplástico PS (1,5, 15 o 30 mg/kg) que contenía una solución de EBD 10 mM. Los ratones de control recibieron una inyección intravenosa de solución de EBD 10 mM. Después de 24 h, los ratones se sacrificaron para recolectar los órganos para obtener imágenes utilizando el sistema de imágenes NEWTON 7.0.

Se obtuvieron seis ratones suizos machos de 10 semanas de edad de Ensiweier Biotechnology Co, Ltd. (Chongqing, China). Todos los experimentos con ratones in vivo se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Southwest. A los ratones suizos machos se les suministró libre acceso a comida y agua y se mantuvieron en una temperatura estándar y un ambiente húmedo con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los ratones suizos macho recibieron una inyección intravenosa de solución de EBD 10 mM. Luego, los ratones fueron anestesiados con isoflurano e inyección subcutánea con PBS o 30 mg/kg de nanoplástico PS. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical 15 min después de haber recibido las inyecciones subcutáneas. Luego, las regiones de la piel se extirparon para extraer el colorante extravasado mediante formamida desionizada. Finalmente, se transfirieron 100 µl del sobrenadante que contenía el colorante de cada muestra a un pocillo separado de una placa de 96 pocillos. Las señales de fluorescencia de las muestras se cuantificaron a 624 nm con un lector de microplacas.

Los ensayos in vitro, incluida la viabilidad celular, la producción de ROS, los ensayos transwell in vitro y ex vivo, la extracción de ARN, la transferencia Western y las imágenes de microscopía confocal, se derivaron de al menos tres muestras biológicas (n = 3). El grado de fuga endotelial se expresó mediante el área de brecha y la distribución, que se derivaron de las imágenes utilizando el complemento de segmentación Weka entrenable en el software ImageJ 1.53c.

Los gráficos de datos y el análisis estadístico se realizaron con GraphPad Prism versión 9.3.1 (GraphPad Software, La Jolla) y Origin 7.5. Todos los datos se expresaron como medias ± desviaciones estándar (DE), se analizaron mediante ANOVA de una o dos vías, y se siguieron con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, como se indica en las leyendas de las figuras respectivas. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen que subyacen al texto principal respectivo (Figs. 1–4, 6) y Figuras complementarias (Figs. complementarios 1, 2, 4, 5, 9–13, 18 y 19) se proporcionan como archivo de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Los datos de origen para la figura 5 y las figuras complementarias 14 a 17 se depositaron en el servidor web https://dlab.clemson.edu/research/NanoPlasticEL/. Los datos de descripción para el dímero s y el dímero x se depositaron en Protein Data Bank (PDB) con los códigos de acceso 3PPE y 4ZT1. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFA1200900 CC y PCK), el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Guangdong (2019GD0101 CC), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (21976145 YS, 21974110 YS y 82104087 YL), Fundación Nacional de Ciencias (CAREER CBET-1553945 FD) e Institutos Nacionales de Salud (MIRA R35GM119691 FD).

Estos autores contribuyeron igualmente: Wei Wei, Yuhuan Li.

Laboratorio Estatal Clave de Química Ambiental y Ecotoxicología, Centro de Investigación de Ciencias Ecoambientales, Academia China de Ciencias, Beijing, 100085, China

Canción de Wei Wei y Yang

Laboratorio clave de análisis de luminiscencia y detección molecular, Ministerio de Educación, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Southwest University, 2 Tiansheng Rd, Beibei District, Chongqing, 400715, China

wei wei

Instituto de Cáncer de Hígado, Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan, Shanghái, 200032, China

Yuhuan Li

Administración, disposición y dinámica de fármacos, Instituto Monash de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Monash, 381 Royal Parade, Parkville, VIC, 3052, Australia

Yuhuan Li, Nicholas Andricopoulos y Pu Chun Ke

Departamento de Física y Astronomía, Universidad de Clemson, Clemson, SC, 29634, EE. UU.

Myeongsang Lee y Feng Ding

Facultad de Ciencias Ambientales e Ingeniería, Universidad de Tongji, 1239 Siping Road, Shanghái, 200092, China

sijie lin

CAS Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety, Centro Nacional de Nanociencia y Tecnología de China, Beijing, 100190, China

Chunying Chen

Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad Nacional de Singapur, 4 Engineering Drive 4, Singapur, 117585, Singapur

David Tai Leong

Centro de Nanomedicina, Instituto Nacional de Innovación en Nanotecnología del Área de la Gran Bahía, 136 Kaiyuan Avenue, Guangzhou, 510700, China

Pu Chun Ke

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PCK concibió el proyecto. PCK, DTL, YS, FD, CC y SL contribuyeron al diseño del proyecto. YL, WW, ML y PCK escribieron el manuscrito. WW y YS realizaron transwell in vitro y ex vivo, vías de señalización, ROS, autofagia, apoptosis y ensayos in vivo. YL y NA realizaron TEM, DLS, potencial zeta, microscopía de fluorescencia confocal, transwell y análisis de áreas de brecha. ML y FD realizaron simulaciones y análisis de DMD y sDMD. YL realizó un análisis general de datos experimentales y una representación de figuras. Todos los autores discutieron y acordaron la presentación del manuscrito.

Correspondencia con Yang Song o Pu Chun Ke.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Elena Del Favero, Guang Wang y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Wei, W., Li, Y., Lee, M. et al. La exposición a nanoplásticos aniónicos induce fugas endoteliales. Nat Comun 13, 4757 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32532-5

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Recibido: 02 Diciembre 2021

Aceptado: 03 agosto 2022

Publicado: 13 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32532-5

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