El control general no depresible 1 interactúa con el transportador de aminoácidos catiónicos 1 y afecta la fecundidad de Aedes aegypti

May 04, 2023

Parásitos y vectores volumen 15, Número de artículo: 383 (2022) Citar este artículo

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La proteína transportadora de aminoácidos catiónico transportador de aminoácidos 1 (CAT1) es parte del sensor de nutrientes en el cuerpo graso de los mosquitos. Miembro de la familia SLC7 de transportadores de aminoácidos catiónicos, es primordial para la detección de niveles elevados de aminoácidos en la hemolinfa del mosquito después de una comida de sangre y los cambios posteriores en la expresión génica en el cuerpo graso.

Realizamos una nueva anotación de los transportadores de aminoácidos catiónicos (CAT) de Aedes aegypti y seleccionamos la cola C-terminal de CAT1 para realizar una pantalla de dos híbridos de levadura para identificar interactores putativos de esta proteína. Una proteína de interacción interesante que identificamos fue el control general no depresible 1 (GCN1). Determinamos el patrón de expresión de GCN1 en varios órganos y estructuras de adultos mediante qRT-PCR y transferencias Western. Finalmente, derribamos GCN1 usando ARN de doble cadena e identificamos cambios en los intermediarios de señalización aguas abajo y los efectos de la caída en la vitelogénesis y la fecundidad.

En una pantalla para Ae. aegypti CAT1-proteínas que interactúan identificamos GCN1 como un interactor putativo. GCN1 se expresa en gran medida en los ovarios y el cuerpo graso del mosquito. Proporcionamos evidencia de que la fosforilación de la subunidad alfa del factor 2 de iniciación de la traducción eucariótica (eIF2α) cambió durante la vitelogénesis y que la eliminación de la interferencia del ARN de GCN1 en mosquitos completos redujo el tamaño de la nidada de huevos de los mosquitos tratados en relación con los controles.

Aedes aegypti CAT1 y GCN1 son probablemente socios que interactúan y GCN1 es probablemente necesario para el desarrollo adecuado del huevo. Nuestros datos sugieren que GCN1 es parte de un mecanismo sensor de nutrientes en varios tejidos de mosquitos involucrados en la vitelogénesis.

La capacidad de detectar nutrientes y realizar un seguimiento de los cambios en los niveles de nutrientes es de suma importancia para la función y la supervivencia celular, así como para el mantenimiento de la homeostasis en los organismos multicelulares. Las células eucariotas utilizan una variedad de vías de detección y señalización para rastrear concentraciones específicas de nutrientes y estado de energía [1]. Los aminoácidos son los componentes básicos de todas las proteínas que produce la célula para realizar las funciones necesarias para la supervivencia y el crecimiento. Se han identificado dos vías de detección de aminoácidos conservadas en eucariotas: (i) la vía de señalización del complejo 1 (mTORC1) del objetivo mecanístico de la rapamicina (mTOR); y (ii) la vía de control general de aminoácidos (GAAC), que se describió por primera vez en la levadura y, a veces, en los mamíferos se denomina vía de respuesta de aminoácidos (AAR) [2,3,4]. Ambas vías regulan la síntesis de nuevas proteínas en respuesta al contenido celular de aminoácidos libres, y se sabe que la vía mTORC1 integra información de factores de crecimiento, estado energético y disponibilidad de nutrientes para regular el crecimiento celular [2,3,4,5].

La activación de mTORC1 se logra mediante el reclutamiento del complejo en las membranas lisosomales, donde se propone detectar el contenido de aminoácidos libres del lisosoma o interactuar con otros genes metabólicos de aminoácidos citoplasmáticos [2,3,4]. Una vez activada, la quinasa TOR en mTORC1 fosforila otra quinasa, la proteína ribosómica S6 quinasa beta-1 (p70-S6K), que a su vez fosforila la proteína ribosómica S6, "activando" así la síntesis de proteínas [3, 4, 6]. La quinasa central en la vía GAAC es el control general no depresible (GCN) 2 (GCN2), que se activa en respuesta a varios factores de estrés celular, incluidos los niveles bajos de aminoácidos intracelulares [7,8,9,10,11]. GCN2 detecta estos niveles con la ayuda de otra proteína, control general no desreprimible 1 (GCN1), que forma un complejo con varias proteínas, incluida GCN2, control general no desreprimible 20 (GCN20) y ribosomas, lo que permite que GCN2 detecte ARN de transferencia sin carga (ARNt) en el sitio A ribosomal [12,13,14,15] y fosforilan la subunidad alfa del factor 2 de iniciación de la traducción eucariota (eIF2α) en respuesta [12,13,14,15,16,17,18]. La fosforilación de eIF2α provoca una reducción en la traducción general y mejora la traducción de un subconjunto de genes, incluido GCN4 (en mamíferos, activando el factor de transcripción 4 [activando el factor de transcripción 4]) que responde a condiciones de privación de aminoácidos [19,20,21,22 ]. Se están realizando esfuerzos para comprender cuánta diafonía se produce entre las vías de señalización mTORC1 y GCN2 [23,24,25,26].

El mosquito hembra de la fiebre amarilla (Aedes aegypti) es un sistema modelo excelente para estudiar las vías de señalización de aminoácidos que están activas en una variedad de órganos y tejidos [27, 28]. Los mosquitos hembra de esta especie requieren una comida de sangre para obtener los nutrientes necesarios para la producción de huevos. Una vez que la sangre se ingiere en el intestino medio, los nutrientes, particularmente los aminoácidos de las proteínas sanguíneas digeridas, se secretan en la hemolinfa desde donde son absorbidos por el cuerpo graso y utilizados para producir proteínas precursoras de la yema (YPP). Los YPP se procesan en el cuerpo graso, se secretan en la hemolinfa y los ovocitos en desarrollo los absorben mediante endocitosis mediada por receptores. El proceso crítico de formación de la yema en los huevos se denomina vitelogénesis [29].

La absorción de aminoácidos por parte del cuerpo graso es esencial para el inicio de la vitelogénesis, y los aminoácidos catiónicos son absolutamente necesarios para la expresión de los YPP [30, 31]. El transporte de aminoácidos catiónicos al cuerpo graso durante la vitelogénesis es facilitado por proteínas de la familia de transportadores de solutos 7 (SLC7), incluidos los transportadores de aminoácidos heterodiméricos (HAT) y los transportadores de aminoácidos catiónicos (CAT) [32]. Las proteínas CAT son transceptores de 14 dominios transmembrana, es decir, transportadores que se cree que también actúan como receptores [33], cuya especificidad de sustrato está determinada por una región de 80 aminoácidos que se extiende desde el cuarto bucle intracelular hasta los siguientes dos dominios transmembrana (dominios IX y X) [34]. Se ha demostrado que los CAT juegan un papel importante en Ae. aegypti YPP síntesis durante la vitelogénesis, como se demuestra a través de la caída de interferencia de ARN (RNAi) [32]. Cinco proteínas CAT se han clasificado en Ae. aegypti [32], y se han caracterizado la especificidad de sustrato y la dinámica de transporte de dos de estos [30, 35, 36]. Aedes aegypti CAT 1 (AaCAT1) transporta selectivamente histidina [36], mientras que Ae. aegypti CAT 3 (AaCAT3) funciona como un transceptor de aminoácidos catiónico más general, mostrando una ligera preferencia por la arginina [35]. Los perfiles de sustrato de los AaCAT restantes no se han clasificado.

Se ha demostrado previamente que los miembros de la familia CAT son parte de la vía de señalización de mTOR. Eliminación de ARNi de Ae. aegypti CAT 2 (AaCAT2) y AaCAT3 redujeron significativamente las cantidades de p70-S6K fosforilado después de la estimulación de cuerpos grasos cultivados con aminoácidos [32]. Mientras que el vínculo entre la captación de aminoácidos mediada por CAT y la regulación mTOR de la expresión del gen YPP en el cuerpo graso de Ae. aegypti se ha establecido firmemente, todavía no existe un intermediario de señalización establecido experimentalmente entre los CAT y el sensor de nutrientes mTOR.

Aquí presentamos evidencia de que AaCAT1 interactúa con GCN1 en Ae. aegypti, y que la eliminación de GCN1 afecta la señalización de nutrientes y el desarrollo de ovocitos de mosquitos.

Se usaron mosquitos Aedes aegypti (cepa Liverpool) para todos los experimentos. Los huevos se desecaron durante al menos 1 semana antes de la eclosión en 13 × 20 pulgadas. cacerolas, en agua desionizada a 27 °C. Las larvas se alimentaron con gránulos de comida seca para gatos Special Kitty (Walmart Stores Inc., Bentonville, AR, EE. UU.) cada 3 días, y el agua de cada plato se cambió cada 5 días. Las pupas se separaron en platos y se almacenaron en jaulas de cría de insectos Bug Dorm-1 (30 × 30 × 30 cm; Bugdorm, Taichung, Taiwán) y se les permitió emerger. Los mosquitos adultos se mantuvieron en sus jaulas Bug Dorm en condiciones controladas (27 °C, 80 % de humedad, ciclo de luz:oscuridad de 14:10 h) y se alimentaron con soluciones de sacarosa al 20 % ad libitum. Se utilizaron hembras adultas de 5 a 7 días después de la eclosión para todos los experimentos.

Se accedió a las secuencias de proteínas CAT de Aedes aegypti de una publicación anterior [32] y de la base de datos de proteínas del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Se accedió a las secuencias de proteínas de Drosophila melanogaster desde FlyBase versión FB2021_04 [37]. Todo Ae. Las secuencias de proteínas de aegypti y D. melanogaster se alinearon usando el software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versión 11 [38] usando la configuración predeterminada, y se construyó un árbol de unión de vecinos usando la configuración predeterminada en MEGA 11. Nodos que contienen variantes de transcripción o secuencias homólogas se colapsaron y la información de anotación relevante se agregó manualmente al árbol.

Las alas, patas y cabezas de 100 mosquitos adultos hembra alimentados con sangre fueron removidas y desechadas. El tejido restante se colocó en tubos Eppendorf de 2 ml con 0,5 ml de reactivo TRIzol® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). El tejido se homogeneizó usando un motor inalámbrico VWR (VWR, Avantor; Radnor, PA, EE. UU.; Cat. No. 4774-370) con morteros desechables de tereftalato de polibutileno (VWR, Avantor; Cat. No. 4774-358), y otros 0,5 ml de TRIzol antes de mezclar los tubos por inversión. El ARN total se aisló y precipitó utilizando el protocolo de aislamiento de ARN con TRIzol:cloroformo. Después de la separación de fases, se separó la fase acuosa que contenía el ARN total y se añadió un volumen equivalente de etanol al 100 % a la fase acuosa y se mezcló. Luego, las muestras se purificaron con un kit Zymo RNA Clean and Concentrator 100 (Zymo Research, Irvine, CA, EE. UU.; Cat No. R1019) y se realizó un tratamiento con DNasa en la columna para eliminar el ADN genómico. El enriquecimiento del ARN mensajero (ARNm) se realizó utilizando el protocolo de purificación de ARN poliadenilado de Takara (Takara Bio USA Inc., San Jose, CA, EE. UU.). A continuación, se midieron las concentraciones de ARN en un espectrofotómetro Nanodrop™ 1000 (Thermo Fisher Scientific).

Las bibliotecas de ADN complementario (ADNc) se construyeron utilizando el sistema de biblioteca Make Your Own "Mate & Plate" (Takara Bio USA Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, 2 µl de muestra de ARN purificado, 1 µl de solución de cebador de desoxitimidina oligomerizada (oligo-dT) (CDSIII) y 1 µl de agua desionizada se incubaron durante 2 min a 72 °C y luego se enfriaron en hielo durante 2 min antes de centrifugar. hacia abajo brevemente a 14.000 g durante 10 s. Para completar la mezcla de reacción, se añadieron a la solución 2,0 µl de solución tampón de primera cadena 5x, 1,0 µl de ditiotreitol (DTT; 100 mM), 1,0 µl de mezcla de desoxirribonucleósido trifosfatado (NTP) (10 mM) y 1,0 µl de transcriptasa inversa SMART MMLV. . La mezcla de reacción resultante se incubó a 42 °C durante 10 min antes de añadir 1 µl de oligo-dT modificado con SMART III. Luego, la solución se mezcló y se incubó a 42 °C durante 1 h. La mezcla de reacción se calentó a 75 °C durante 10 min para terminar la síntesis de la primera cadena y luego se enfrió a temperatura ambiente. Finalmente, a la mezcla de reacción se le añadió 1 µl de RNasa H, la cual se incubó a 37 °C durante 20 min.

La biblioteca de cDNA se generó mediante amplificación por PCR de larga distancia utilizando Advantage 2 Polymerase Mix (Takara Bio USA Inc.). La mezcla de reacción constaba de 2 µl de ADNc de la primera cadena, 70 µl de agua desionizada, 10 µl de tampón de PCR Advantage 2 10x, 2 µl de mezcla de dNTP 50×, 2 µl de cebador de PCR 5', 2 µl de cebador de PCR 3', 10 µl de 10 × solución de fusión y 2 µl de mezcla de polimerasa Advantage 2 50×. La amplificación se realizó en un Eppendorf EPgradient MasterCycler (Eppendorf North America, Enfield, CT, EE. UU.) aplicando los siguientes parámetros de ciclo: 95 °C durante 30 s; luego 26 ciclos de 95 °C por 10 s y 68 °C por 6 min; con un ciclo final a 68 °C durante 5 min.

Topología de membrana del Ae. aegypti AaCAT1 (XP_021707900.1) se predijo utilizando la herramienta de predicción transmembrana ExPASy TMHMM v2.0 [39] y la herramienta de predicción transmembrana Protter [40], lo que resultó en la identificación de las regiones N-terminal, C-terminal e intracelular. La función TBLASTN del programa NCBI BLAST [41] se utilizó para identificar la secuencia de nucleótidos de la secuencia intracelular C-terminal en Ae. Uso del codón aegypti. Los cebadores que flanquean la secuencia intracelular C-terminal se diseñaron utilizando NCBI Primer-BLAST [42] y se validaron de forma cruzada con NetPrimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/). Se agregaron secuencias adaptadoras a los extremos de los cebadores directo e inverso como se especifica en el Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid Kit (Takara Bio USA Inc.) para asegurar la inserción del fragmento de cebo en el plásmido de cebo pGBKT7 para usar en Matchmaker Gold Yeast Kit de dos híbridos. Las secuencias de cebadores completas (con las regiones adaptadoras indicadas en cursiva) son las siguientes: adelante: 5′-CATGGAGGCCGAATTCCATTCGGTTCTTGGCTCCGGTAGT-3′; inversa—5′-GCAGGTCGACGGATCCTACGCCTTTTCGAGTCCTACCATG-3′.

La PCR para generar el fragmento de cebo AaCAT1 se realizó usando un Eppendorf EPgradient Mastercycler (Eppendorf North America) para generar el fragmento de cebo para la selección de dos híbridos. Los cebadores de cebo se usaron en la reacción con las bibliotecas de ADNc generadas en el paso anterior actuando como molde. Se usó el kit de clonación In-Fusion HD (Takara Bio USA Inc.) para clonar los fragmentos cortos y largos en el vector plasmídico pGBKT7. A continuación, se usó el kit Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Takara Bio USA Inc.) para transformar los plásmidos cebo en células de levadura competentes de la cepa Y2HGold siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las células de levadura competentes de la cepa YI87 se prepararon primero de acuerdo con el protocolo de transformación de levadura en el Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Takara Bio USA Inc.). Luego se usó el sistema de biblioteca Make Your Own "Mate & Plate" (Takara Bio USA Inc.) para completar la construcción de la biblioteca de dos híbridos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se usó el sistema Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid (Takara Bio USA Inc.) para aparear las cepas de levadura cebo (Y2HGold) y presa (Y187) siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, la levadura acoplada se sembró en medio de crecimiento sintético definido (SD) que carecía de leucina y triptófano (medio de doble eliminación [DDO]) suplementado con aureobasidina y X-alfa-Gal, un sustrato cromogénico de la enzima α-galactosidasa.

Para descartar posibles falsos positivos, se recogieron colonias azules y se parchearon en DDO fresco que carecía de adenina e histidina (medios de eliminación cuádruple [QDO]). Las colonias parcheadas se cultivaron en medio QDO durante 3 días antes de otra ronda de selección de colonias azules. Debido a que la levadura puede transportar múltiples plásmidos distintos, fue necesario seleccionar cualquier plásmido presa que no interactúe y que pueda albergar colonias azules después del crecimiento en medios QDO. Para hacer esto, se recogieron colonias azules de medios QDO y se parchearon en medios DDO frescos. Las colonias se parchearon en medio DDO fresco dos veces, y solo las colonias azules al final de esta selección se mantuvieron para el análisis de posibles interacciones.

Después de dos rondas de selección en DDO, la composición de insertos de presa de las colonias azules restantes se verificó mediante PCR de colonias utilizando Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 (Takara Bio USA Inc.). Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en un tampón de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) Tris-acetato al 1 % (TAE) agarosa/gel SYBR Safe. La aparición de más de una banda era una indicación de la presencia de más de un plásmido presa en una célula. Los productos de PCR que produjeron bandas individuales se purificaron y enviaron a Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) para su secuenciación. NCBI BLAST [43] se utilizó para identificar el Ae. secuencias del gen aegypti correspondientes a los datos de la secuencia del plásmido presa. Se seleccionó un conjunto de interactores AaCAT1 putativos de este conjunto de datos mediante la eliminación de falsos positivos obvios, como colonias que contienen plásmidos sin inserto de mosquito conocido, y se seleccionaron interactores que se sabe que se localizan en el citosol y la membrana plasmática, ya que estas dos ubicaciones representan las regiones donde es más probable que las proteínas interactúen con AaCAT1.

El aislamiento de proteínas de mosquitos en los experimentos descritos en este documento se realizó como sigue. Se quitaron las patas, cabezas y alas de los mosquitos, y las estructuras se diseccionaron según fuera necesario para cada ensayo descrito en los Resultados. Los órganos y estructuras disecados se homogeneizaron usando un motor inalámbrico VWR (VWR, Avantor; Cat. No. 4774-370) con manos de tereftalato de polibutileno desechables (VWR, Avantor; Cat. No. 4774-358) en 100 µl de tampón de lisis (50 Tris mM, pH 7,4; octilfenoxipoli(etilenoxi)etanol al 1 %, ramificado [IGEPAL]; desoxicolato de sodio al 0,25 %; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM) suplementado con 1 µl de cóctel inhibidor de proteasa HALT™ y cóctel inhibidor de fosfatasa HALT™ (ambos de Thermo Fisher Scientific). Las muestras homogeneizadas se centrifugaron durante 10 min a 12.700 RPM y 4 °C para sedimentar los desechos. Se recogió el sobrenadante que contenía proteínas y se determinó la concentración de proteínas con un kit de ensayo de proteínas Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientific) en un espectrofotómetro NanoDrop™ 1000 (Thermo Fisher Scientific) usando el programa Protein BCA.

Se sintetizó de forma personalizada (Pierce Biotechnology, Thermo Fisher Scientific) un fragmento de cebo AaCAT1 C-terminal marcado con 6 histidina (6-His) ([NH2]HHHHHHHSVLGSGSQTLSESQLENPFCMVGLEKA[COOH]) y se usó junto con una proteína Pierce™ Pull-Down PolyHis :Protein Interaction Kit (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific) con varias modificaciones.

Un conjunto de muestras de proteínas se entrecruzaron con el cebo AaCAT1 marcado con 6-His antes de la extracción. Brevemente, se disolvió 1 mg de disuccinimidil sulfóxido (DSSO) de reticulante en 51,5 µl de dimetil sulfóxido (DMSO) para obtener una solución madre 50 mM. A continuación, aproximadamente 800 µg de proteína aislada total de cuerpos grasos se mezclaron con CAT1 C-terminal marcado con 6 His a una concentración de 200 µg/ml en solución salina tamponada con Tris (TBS) para generar dos muestras de cuerpos grasos. Se añadió una alícuota de 50 µl de reticulante disuelto a una muestra de cuerpo graso, y se añadieron 50 µl de DMSO a un cuerpo graso no reticulado como control. Las muestras se incubaron a 4 °C durante la noche para facilitar el entrecruzamiento antes de su uso en las reacciones desplegables. Para los pull-downs de proteínas, se centrifugaron 500 µl de resina de cobalto His-Pur por muestra durante 2 min a 700 gy temperatura ambiente, y se eliminó el sobrenadante del lecho de resina. A continuación, la resina se equilibró en 500 µl de tampón de lavado (mezcla 1:1 de tampón TBS:Pierce Lysis más imidazol 5 mM) y se centrifugó usando los mismos ajustes que antes. Se eliminó el tampón de lavado y las muestras de proteína se agregaron a la resina y se mezclaron a temperatura ambiente con agitación suave durante 1 hora para facilitar la unión de las proteínas etiquetadas con 6-His reticuladas a las perlas de resina His-Pur. Después de mezclar, las muestras se centrifugaron como se indicó anteriormente y el sobrenadante se recogió y retuvo. Las perlas se lavaron 3 veces con 200 µl de tampón de lavado cada vez y, después de cada lavado, las muestras se centrifugaron como se describe anteriormente y el sobrenadante se recogió y retuvo cada vez. Finalmente, las proteínas unidas se eluyeron en 100 µl de tampón de elución (tampón de lavado que contenía imidazol 290 mM). Después de volver a suspender las perlas en el tampón de elución, las muestras se centrifugaron como se describe anteriormente y se recogió el sobrenadante.

Se extrajo un segundo conjunto de muestras de proteínas sin entrecruzamiento. En resumen, se llenaron tres tubos Eppendorf de 1,7 ml (control solo con cebo, control de resina y desplegable) con 200 µl de resina de cobalto HisPure y se equilibraron con cinco lavados de 1,2 ml de solución de lavado (mezcla 1:1 de TBS: tampón de lisis Pierce más imidazol 5 mM). Se agregaron aproximadamente 500 µg de proteína de cebo a los tubos de control y desplegables de cebo solamente, y se agregó un volumen equivalente de solución de lavado al tubo de control de resina. Todos los tubos se incubaron a 4 °C con balanceo suave durante 2 h para facilitar la unión de los péptidos de cebo marcados con 6-His a la resina de cobalto HisPure. Después de la incubación, se eliminó el sobrenadante y las perlas se lavaron una vez con 400 µl de solución de lavado. Se agregaron aproximadamente 2 mg de lisado de proteína total (ver arriba para el protocolo de extracción de proteína) tanto al control de resina como a los tubos desplegables y se agregó un volumen equivalente de solución de lavado al tubo de control solo con cebo. Todos los tubos se incubaron a 4 °C con movimientos suaves durante la noche para facilitar la interacción entre el cebo inmovilizado y las proteínas de presa. Al día siguiente, las perlas se transfirieron a las columnas giratorias proporcionadas y el flujo de cada muestra se recogió después de la centrifugación. Se añadió tampón de lavado (250 µl) que contenía imidazol 290 mM a cada columna, y las columnas se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min con balanceo suave seguido de centrifugación para recoger las proteínas eluidas.

Cebadores de ARN de doble cadena conjugado con T7 (dsRNA) para Ae. aegypti GCN1 se diseñaron a partir de ARNm (acceso a la secuencia de referencia de GenBank: XM_001651776.2), y los cebadores de dsRNA de proteína fluorescente verde (GFP) se tomaron de un estudio anterior [44] (Tabla 1). Total Ae. aegypti cDNA y un plásmido que contiene GFP (3' EGFP pXOON) se usaron como plantillas para producir dsDNA marcado con T7 para usar en la síntesis de dsRNA usando el Megascript™ RNAi Kit (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se inyectaron mosquitos hembra adultos por vía oral con 1 µl de aproximadamente 1 µg/µl de dsRNA por vía intratorácica usando capilares de vidrio estirados y se les dio 1 h para recuperarse en jaulas de cría de insectos Bug Dorm-1 con 20% de sacarosa proporcionada. Después de 1 h, se descartaron los mosquitos que no se habían recuperado. Los mosquitos inyectados supervivientes se mantuvieron utilizando las condiciones de cría descritas anteriormente hasta su uso en experimentos posteriores. Todas las inyecciones se realizaron en hembras entre 5 y 7 días después de la eclosión para estandarizar las edades de los mosquitos con todos los demás experimentos realizados.

La proteína total se aisló como se describe anteriormente a partir de grupos de varios órganos o estructuras para cada ensayo. La proteína total se mezcló con un volumen equivalente de tampón Laemmli:beta-mercaptoetanol 1:1 y se calentó a 95 °C durante 10 min para desnaturalizar las proteínas. Las muestras se cargaron en geles de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio al 7,5 % (SDS-PAGE) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) y se corrieron a 100 V durante 90 min (GCN1) o 60 min (todas las demás proteínas). ) utilizando una fuente de alimentación PowerPac™ HC (Bio-Rad Laboratories) para separar proteínas. Las proteínas se transfirieron del gel a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) usando pilas de transferencia preparadas previamente (Bio-Rad Laboratories) en un sistema de transferencia Trans-Blot® Turbo™ (Bio-Rad Laboratories) usando la transferencia preestablecida estándar de 30 min. correr. Las membranas de PVDF se lavaron 3 veces durante 5 min en TBS 1x + Tween-20 al 0,05 % (TBST) y se bloquearon en StartingBlock™ T20 (TBS) (Thermo Fisher Scientific) durante 1 h a temperatura ambiente con balanceo suave. Las membranas se incubaron con anticuerpo primario (Tabla 2) diluido en tampón de bloqueo a 4 °C durante la noche con agitación suave, seguido de tres lavados de 5 min cada uno en TBST y luego por incubación con un anticuerpo secundario apropiado (Tabla 2) diluido en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. Luego, las membranas se lavaron 5 veces durante 5 min cada vez en TBST para eliminar cualquier anticuerpo secundario libre y luego se incubaron en solución de sustrato de transferencia TMB de 1 paso Pierce (Thermo Fisher Scientific) para detección colorimétrica durante hasta 30 min a temperatura ambiente con balanceo suave. Como alternativa, las transferencias se incubaron en sustrato quimioluminiscente Li-Cor WesternSure® PREMIUM (Li-Cor, Lincoln, NE, EE. Cor) y el software Image Studio™ (Li-Cor); las intensidades de píxeles se determinaron utilizando este software para mediciones de densitometría semicuantitativas.

Se diseccionaron los órganos y las estructuras de los mosquitos y se extrajo el ARN total utilizando un mini kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania). Se agruparon diez órganos y estructuras para generar muestras individuales, y se utilizó un tamaño de muestra de tres para todos los experimentos de PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). Las concentraciones potenciales de ARN y ADN genómico se midieron con un Qbit 2.0 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), y la calidad del ARN se confirmó con un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Una alícuota de 250 ng de ARN de cada muestra se transcribió de forma inversa utilizando iScript™ Reverse Transcription Supermix para RT-qPCR (Bio-Rad Laboratories) para generar ADNc. Para confirmar la ausencia de contaminación por ADN genómico, se generaron muestras con transcripción no inversa (noRT) con iScript™ noRT Supermix (Bio-Rad Laboratories). Los cebadores para gcn1 se diseñaron con PrimerBLAST [42] y se evaluaron con NetPrimer (Premier Biosoft, Palo Alto, CA, EE. UU.). Los cebadores se diseñaron para flanquear secuencias de intrones para discriminar entre productos de amplificación de ARNm y ADN genómico. Los cebadores para los genes de vitelogenina (vg), beta-actina (β-actina) y proteína ribosomal S7 (rps7) se han publicado previamente [45, 46] (consulte la Tabla 3 para ver todas las secuencias de cebadores). Todos los cebadores qRT-PCR se sintetizaron en la escala de 10 nmol con purificación por desalinización estándar (Eurofins Genomics, Louisville, KY, EE. UU.).

Debido a que la expresión del gen de referencia puede diferir entre diferentes órganos o en diferentes puntos durante la vitelogénesis, se utilizó la herramienta RefFinder [47] para identificar el gen de referencia expresado de manera más estable para cada ensayo de qRT-PCR. Para el perfil de expresión de gcn1 en órganos y estructuras de adultos, se determinó que rps7 era la referencia adecuada, mientras que β-actina se determinó que era la referencia adecuada para analizar la transcripción de vg después del tratamiento con ARNi. Todas las corridas de qRT-PCR se realizaron diluyendo cDNA 1:1 en agua libre de nucleasas y mezclando los siguientes componentes en placas transparentes de 96 pocillos (Genesee Scientific, El Cajon, CA, EE. UU.) en hielo: 5 µl iTaq Universal SYBRgreen Supermix ( Bio-Rad Laboratories), 1 µl de cebadores específicos de genes directos e inversos mixtos 1:1, 1 µl de ADNc diluido y 2 µl de agua libre de nucleasas. Las placas se centrifugaron brevemente para recoger todo el material del fondo de los pocillos y se sellaron con una película adhesiva de plástico transparente ThermalSeal RTS™ (Excel Scientific Inc., Victorville, CA, EE. UU.). Todos los ensayos de qRT-PCR se realizaron en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories) controlado por una computadora usando el software CFX Maestro (Bio-Rad Laboratories) y el siguiente perfil de ciclo: una desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s; seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 s y un recocido/elongación combinado a 60 °C durante 30 s. La medición fluorescente se realizó después de cada paso de elongación. Las curvas de fusión de 65 °C a 95 °C en incrementos de 0,5 °C con una retención de 5 s en cada paso se realizaron inmediatamente después de cada qRT-PCR. La eficiencia de amplificación del par de cebadores se determinó utilizando los datos de fluorescencia sin procesar en la herramienta Real-Time PCR Miner [48]. Los valores promedio del ciclo de cuantificación (Cq) de las réplicas técnicas de cada muestra se analizaron usando las eficiencias del par de cebadores determinadas por la herramienta Real-Time PCR Miner, y los valores de gcn1 o vg Cq se normalizaron a valores de rps7 o β-actina Cq, respectivamente, para cuantificar los cambios en la expresión génica.

Grupos de hembras Ae. aegypti (5 a 7 días después de la eclosión) se inyectaron con dsRNA de GCN1 o dsRNA de GFP como se describe en el texto anterior. Cinco días después de la inyección (PI), los mosquitos sobrevivientes de ambos grupos fueron alimentados con sangre durante 1 hora usando sangre bovina desfibrinada (HemoStat Laboratories, Dixon, CA, EE. UU.) calentada a 37 °C. Los mosquitos hinchados individuales se trasladaron a cámaras de puesta de huevos y se mantuvieron en las condiciones de crianza descritas anteriormente durante 96 h para garantizar el tiempo adecuado para que completaran la vitelogénesis y la oviposición. Se recolectaron papeles de huevo de cada cámara de huevos y se secaron durante 96 h antes del conteo para determinar el tamaño promedio de puesta de cada tratamiento. Después del conteo, los huevos fueron desecados por un mínimo de 72 h adicionales (total de al menos 1 semana de desecación). Para determinar las tasas de eclosión, se seleccionaron al azar 12 hojas de huevo de cada tratamiento y se colocaron en platos pequeños que contenían agua desionizada y un cuarto de gránulo de alimento para gatos Special Kitty (Walmart Stores Inc.) y se dejaron eclosionar. Se compararon los recuentos de larvas de cada nidada de huevos con el número de huevos contados en cada nidada para calcular las tasas de eclosión.

A los mosquitos hembra 5 a 7 días después de la eclosión se les inyectó GFP o GCN1 dsRNA como se describió anteriormente. A los 5 días PI, los mosquitos hembra recibieron una comida de sangre y se les permitió alimentarse durante 1 hora. Directamente antes de la alimentación con sangre, se aisló un grupo de hembras inyectadas para su uso como muestra de referencia no alimentada. Se tomaron muestras de grupos de 10 mosquitos alimentados con sangre a las 24, 48 y 72 h después de la ingesta de sangre (PBM). Los mosquitos de cada uno de los dos tratamientos de inyección (GFP o GCN1 dsRNA) y cuatro puntos de tiempo (sin alimentar, 24 h PBM, 48 h PBM, 72 h PBM) se anestesiaron en hielo y se diseccionaron sus ovarios. Se midieron y promediaron ambos ovarios de cada mosquito (n = 10) para determinar la longitud promedio de los ovarios por mosquito para cada tratamiento y punto de tiempo. Se midieron cinco ovocitos por mosquito (n = 10) para determinar la longitud promedio de los ovocitos de cada mosquito para cada tipo de tratamiento y punto de tiempo.

Las pruebas de normalidad de las distribuciones de todos los datos se realizaron mediante pruebas de Shapiro-Wilk y gráficos QQ antes de la selección de pruebas estadísticas adicionales. Los datos de GCN1 qRT-PCR de órganos y estructuras de mujeres adultas se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y se determinaron las diferencias significativas entre las muestras mediante una prueba post hoc HSD de Tukey. Las diferencias en los niveles de eIF2α fosforilados entre las muestras inyectadas con dsRNA de GCN1 y GFP en diferentes momentos PBM medido por densitometría de banda de transferencia Western se analizaron mediante un ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc HSD de Tukey para identificar cualquier diferencia significativa entre los tratamientos en cada punto de tiempo . Las diferencias en la expresión de vg entre las muestras inyectadas con dsRNA de GCN1 y GFP medidas por qRT-PCR se analizaron utilizando pruebas t no apareadas en cada punto de tiempo. Las diferencias en las longitudes de los ovarios y los ovocitos de los mosquitos inyectados con dsRNA de GCN1 y GFP también se analizaron mediante pruebas t no apareadas en cada punto de tiempo. Las diferencias en el número de huevos y las tasas de eclosión se analizaron mediante pruebas U de Mann-Whitney. Las curvas de supervivencia de los mosquitos inyectados con dsRNA se analizaron mediante una prueba de Mantel-Cox de rango logarítmico. Los valores de p < 0,05 debían considerarse estadísticamente significativos para todas las pruebas. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software de análisis estadístico Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

En publicaciones anteriores, hemos anotado la familia completa de genes SLC7 en Ae. aegypti [32] e identificó las afinidades del sustrato y las actividades de transporte de dos de los cinco CAT anotados [35, 36]. Posteriormente a estos estudios, se han publicado nuevas anotaciones genómicas para Ae. aegypti [49, 50]. Debido a que algunas de estas anotaciones automáticas asignaron números inconsistentes a CATs particulares, hemos optado por volver a anotar nuestros registros CAT anteriores [32] con las anotaciones actuales disponibles en Entrez Gene, y con los grupos CAT actuales de D. melanogaster de FlyBase versión FB2021_04 [ 37] para el contexto evolutivo (ver Archivo adicional 1: Tabla S1). La alineación de proteínas múltiples en MEGA11 [38] reveló que tanto AaCAT1 como AaCAT3 se agrupan más cerca de D. melanogaster Slimfast (Slif) (Fig. 1a) y, por lo tanto, probablemente representan una duplicación de genes de un ancestro común después de la división evolutiva entre moscas y mosquitos. , hace 250 millones de años (MAA) [51]. Además, durante este análisis, identificamos dos entradas genéticas distintas para Ae. aegypti CAT2 y dos entradas genéticas distintas para Ae. aegypti CAT3 en la base de datos Entrez Gene. Nuestro árbol de unión de vecinos agrupó un Ae. aegypti CAT2 (GeneID: 5575859) junto con nuestra anotación AaCAT1 [32], mientras que el otro Ae. aegypti CAT2 (GeneID: 5571884) agrupado con nuestra anotación AaCAT2 [32] (Fig. 1a). Además, uno de los dos Ae. aegypti CAT3 anotaciones (GeneID: 5575863) agrupadas con nuestra anotación AaCAT3 [32], mientras que la otra Ae. aegypti CAT3 anotación (GeneID: 5575110) agrupada con nuestro Ae. Anotación del transportador de aminoácidos catiónicos 5 (AaCAT5) de aegypti [32] (Fig. 1a).

Pantalla de filogenia e interacción de AaCAT1. a AaCAT1 y AaCAT3 representan una expansión de la familia CAT de Drosophila Slif. Las secuencias de proteínas CAT de Aedes aegypti se descargaron de la base de datos de proteínas del NCBI, y se accedió a las secuencias de proteínas CAT de Drosophila melanogaster (Dmel) desde FlyBase versión FB2021_04 [37]. Las secuencias de proteínas se alinearon utilizando MEGA11 [38], y se generó un árbol de unión de vecinos en MEGA11 a partir de la alineación de secuencias múltiples. Los números junto a cada nodo representan valores de arranque basados ​​en 500 replicaciones. Tanto AaCAT1 como AaCAT3 se han anotado previamente como Slif en Ae. aegypti. Nuestro ensamblaje actual muestra que ambos transportadores comparten homología con D. melanogaster Slif y representan una expansión de la familia de transportadores Slif durante Ae. evolución de aegypti. El cuadro rojo alrededor de AaCAT1 indica su uso en nuestro ensayo de interacción de proteínas. Todos los nombres de genes no precedidos por Dmel son Ae. aegypti CAT anotaciones. Los corchetes alrededor de los grupos de genes representan nuestras reanotaciones sugeridas de Ae. aegypti CATs basados ​​en este árbol. b Estructura transmembrana predicha de AaCAT1. Se utilizó la aplicación web Protter [40] para ilustrar las 14 hélices transmembrana. Se marcó el sitio de especificidad del sustrato [34], y el fragmento de 28 aminoácidos C-terminal utilizado para el cebo en el ensayo Y2H se indica mediante círculos que contienen su código de aminoácido de una sola letra. c Tabla que contiene las cinco principales proteínas que interactúan con al menos dos aciertos distintos determinados por el ensayo Y2H. d Fragmento de cebo AaCAT1 para menús desplegables y fragmentos que interactúan con GCN1. e Análisis desplegable de la interacción AaCAT1-GCN1. El dominio C-terminal de AaCAT1 se incubó con proteínas de cuerpo graso y los complejos resultantes se capturaron en resina de cobalto. La tinción con azul de Coomassie de reacciones desplegables reticuladas (x-linked) y no reticuladas (non) utilizando un fragmento de cebo AaCAT1 marcado con 6-His (igual que en d), y la proteína corporal adiposa revela una banda eluida en el tamaño esperado para la interacción GCN1 (marcada por una flecha). f GCN1 se une al extremo C de AaCAT1. La transferencia Western de las fracciones del ensayo pull-down confirma la presencia de GCN1 en la fracción de elución pull-down (marcada con una flecha). cebo, control de cebo solamente; FT, fracción de flujo continuo; elución, fracción eluida; PD, desplegable; resina, control de resina; lavado, fracción de lavado de resina; Y2H, doble híbrido de levadura; para otros términos, consulte Abreviaturas

El análisis in silico de la secuencia de aminoácidos de AaCAT1 utilizando la herramienta de visualización molecular PyMOL (https://pymol.org/2/) y la herramienta de predicción transmembrana TMHMM v2.0 [39] nos permitió predecir la estructura terciaria de la proteína ( Archivo adicional 1: Figura S1a), así como identificar las regiones transmembrana, intracelular y extracelular de la proteína (Archivo adicional 1: Figura S1b). Usamos estos dominios predichos, junto con la estructura CAT definida por Verrey y colegas [34], para seleccionar el extremo C-terminal de AaCAT1 para usar en la detección de dos híbridos de levadura. También determinamos que AaCAT1 probablemente se localiza en la membrana plasmática y los lisosomas utilizando la herramienta de predicción de localización de proteínas, DeepLoc-1.0 [52] (Archivo adicional 1: Figura S1c).

Nuestra pantalla de dos híbridos de levadura usando la cola C-terminal de AaCAT1 como cebo (Fig. 1b) produjo 207 colonias con el complemento completo de activación del gen informador en medios selectivos de alta rigurosidad QDO (archivo adicional 2: conjunto de datos). Se aislaron plásmidos presa de estas colonias y se secuenciaron. Después de la eliminación de los falsos positivos obvios y probables basados ​​en el análisis de la secuencia del plásmido de la presa y las localizaciones conocidas de tejido y subcelulares de las proteínas de la presa, quedaron 13 probables interactuadores de proteínas (Archivo adicional 1: Tabla S2). De estos, se detectaron cinco interactores en al menos dos colonias distintas (Fig. 1c). El activador de la quinasa alfa eIF2, GCN1, fue el más interesante de estos, ya que identificamos tres colonias distintas derivadas de dos clones separados que contienen plásmidos que codifican péptidos que interactúan desde el extremo C-terminal de GCN1 (Fig. 1c, d), y porque GCN1 se ha demostrado previamente que participa en la regulación GAAC de la traducción en otros eucariotas [7, 9, 10, 14, 53].

Confirmamos la interacción entre AaCAT1 y GCN1 mediante el diseño de un péptido etiquetado con 6-His correspondiente a la misma secuencia de 28 aminoácidos de longitud del extremo C de AaCAT1 utilizada para nuestro cebo de dos híbridos de levadura. La tinción con azul de Coomassie reveló la retención de una banda > 260 kDa en la fracción de elución de los ensayos desplegables tanto reticulados como no reticulados (Fig. 1e). La transferencia de Western de muestras de ensayo desplegable no reticuladas con un anticuerpo anti-GCN1 confirmó la presencia de GCN1 en la fracción de elución desplegable (Fig. 1f).

Las transcripciones de GCN1 en órganos femeninos adultos detectadas por qRT-PCR fueron más altas en los órganos asociados con la digestión de la harina de sangre y la vitelogénesis. Los niveles relativos de ARNm de GCN1 fueron significativamente más altos en ovarios que en cabezas, tórax y túbulos de Malpighian (ovarios/cabezas: ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,0033; ovarios/tórax: ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,0094, ovarios/túbulos de Malpighi: ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,0212) (Fig. 2a). Los cuerpos grasos y el intestino medio, que son otros órganos necesarios para la vitelogénesis, expresaron ARNm de GCN1 a niveles no significativamente diferentes de los de los ovarios (ovarios/cuerpos grasos: ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,2028; ovarios/intestino medio : ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,1877). El análisis de transferencia Western de órganos femeninos adultos reveló que los niveles de proteína GCN1 eran más altos en los ovarios. También detectamos la proteína GCN1 en el cuerpo graso y en los túbulos de Malpighian, pero curiosamente no en el intestino medio. Finalmente, detectamos niveles bajos de proteína GCN1 tanto en la cabeza como en el tórax. Este patrón de expresión coincide con el de muchos de los órganos en los que se ha detectado previamente AaCAT1 [36], y los principales tejidos responsables de la vitelogénesis contienen niveles detectables tanto de AaCAT1 como de GCN1. El análisis in silico de la localización subcelular de GCN1 con DeepLoc-1.0 [52] muestra que es muy probable que GCN1 se localice en el citosol, pero también puede localizarse en el núcleo (Archivo adicional 1: Figura S2a) y contiene varias secuencias de localización nuclear putativas, como se predijo con el cNLS Herramienta Mapper [54] (Archivo adicional 1: Figura S2b, c).

GCN1 se expresa en tejidos asociados a la reproducción y su actividad de señalización se reduce después de la eliminación mediada por ARNi. un perfil qRT-PCR de la expresión de GCN1 en tejidos adultos (arriba) y una transferencia de Western de la expresión de la proteína GCN1 (abajo) revelaron la expresión de GCN1 en ovarios, grasa corporal y túbulos de Malpighian. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc HSD de Tukey para determinar las diferencias significativas (P < 0,05) en la expresión del transcrito de gcn1. Se cargó una alícuota de 15 µg de proteína de cada muestra para la detección por transferencia Western. b Western blot de la expresión de GCN1 después de la inyección de dsRNA. c El porcentaje de expresión de GCN1 en relación con el tratamiento con dsRNA de GFP muestra una disminución similar en la expresión de GCN1 a los 3 y 5 días posteriores a la inyección (PI), con un aumento en la expresión relativa de GCN1 que comienza a los 7 días PI. La intensidad de píxeles de las bandas GCN1 en 2b (293 kDa, flecha) se estandarizó utilizando la intensidad de píxeles de la banda brillante de aproximadamente 50 kDa (punta de flecha), que tenía intensidades similares en todas las muestras. La proteína total se extrajo de grupos de 10 mosquitos completos para cada muestra (n = 1) y se analizaron 15 µg de proteína de cada muestra. d Western blots representativos de fosfo-eIF2α (p-eIF2α), eIF2α y actina de tres grupos de cinco abdómenes femeninos (n = 3), sin el intestino medio, después de la inyección con ARNdc de GCN1 o ARNdc de proteína fluorescente verde (GFP). Los mosquitos inyectados se tomaron muestras en diferentes puntos de tiempo después de la comida de sangre (PBM): 0 (sin alimentar), 6, 12 o 24 h PBM. Se cargó una alícuota de 10 µg de proteína total de cada muestra. e Las intensidades de píxeles de las bandas p-eIF2α de mosquitos inyectados con GCN1 y GFP en blot de 2d se normalizaron a la intensidad de píxeles de las bandas eIF2α de 2d para trazar el cambio en la intensidad de la banda p-eIF2α en diferentes puntos de tiempo PBM. Las letras representan grupos de significación estadística (P < 0,05) según lo determinado por el análisis con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc HSD de Tukey para diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y los puntos de tiempo. FB, cuerpo graso; ÉL, cabeza; VO, ovario; MG, intestino medio; TH, tórax; MT, túbulo de Malpighi; WM, mosquito entero; para otros términos, consulte Abreviaturas

Para determinar un marco de tiempo óptimo para las manipulaciones de ARNi, inyectamos un pequeño número de mosquitos hembra con 1 µg de dsRNA de GCN1 o dsRNA de GFP y aislamos la proteína total de grupos de 10 mosquitos (n = 1) a los 3, 5 y 7 días. días PI. Realizamos transferencias de Western con un anticuerpo contra GCN1 de mamíferos para sondear la expresión de la proteína GCN1 en todas las muestras (Fig. 2b). Las transferencias Western con este anticuerpo primario mostraron una banda de GCN1 de aproximadamente 290 kDa y una banda adicional de aproximadamente 50 kDa con una intensidad constante en todas las muestras (consulte el archivo adicional 1: figura S4d). Usamos densitometría de banda para semicuantificar las intensidades de píxeles de las bandas GCN1 (293 kDa) y las normalizamos a la banda de 50 kDa que usamos como un control de carga casi interno. Se graficó el porcentaje de reducción en la intensidad de la banda GCN1 de las muestras de GCN1 RNAi en relación con las muestras de GFP RNAi en cada punto de tiempo, y observamos una reducción de aproximadamente el 60% en los niveles de proteína GCN1 en las muestras de PI de 3 y 5 días (Fig. 2c).

Para dilucidar el papel de GCN1 en Ae. aegypti vitelogenesis, diseñamos y sintetizamos dsRNA anti-GCN1 para eliminar la expresión del gen GCN1. Debido a que se ha demostrado que GCN1 está involucrado en la señalización de nutrientes y la respuesta de inanición en otros organismos [9,10,11,12, 14, 15, 53], queríamos entender si la caída de GCN1 causaría una letalidad rápida y sería perjudicial para futuras caídas. experimentos en Ae. mosquitos aegypti. Para evaluar la letalidad de la caída de GCN1, inyectamos aproximadamente 200 mosquitos hembra con 1 µg de dsRNA de GCN1 (n = 199) o 1 µg de dsRNA de GFP (n = 205) como control de inyección y medimos el porcentaje de mortalidad durante 5 días PI. Ambos grupos, es decir, los grupos de eliminación y control de GFP, tuvieron una supervivencia > 80 % a los 5 días PI (Archivo adicional 1: Figura S3a). Las tasas de supervivencia de los mosquitos inyectados con dsRNA de GCN1 no fueron significativamente diferentes de las de los controles inyectados con dsRNA de GFP en cualquier momento medido (prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox, χ2 = 0,02547, df = 1, P = 0,8732) (Archivo adicional 1 : Figura S3a).

Se sabe que GCN1 regula GCN2, que a su vez fosforila eIF2α y regula la traducción de proteínas en levadura [12, 14]. Para probar si las inyecciones de dsRNA de GCN1 condujeron a la caída funcional de la actividad de GCN1, realizamos transferencias de Western en tres grupos de proteína total aislados del abdomen de cinco mosquitos en diferentes puntos de tiempo PBM (n = 3 en todos los puntos de tiempo) con el intestino medio eliminado para evitar la sangre. contaminación (Fig. 2d; archivo adicional 1: Fig. S4e-g). Observamos una disminución significativa en la fosforilación de eIF2α en ambos grupos de tratamiento a las 6 h PBM en relación con los mosquitos no alimentados en cada grupo (GCN1 no alimentado-GCN1 6 h PBM: ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,0128; GFP no alimentado- GFP 6 h PBM: ANOVA, F (7,16) = 5.562, P = 0.0183) (Fig. 2e). Esto indica que la vía GAAC es un interruptor de detección de nutrientes activo en Ae hembra. aegypti a medida que metabolizan una comida de sangre durante la vitelogénesis.

Al comparar la fosforilación de eIF2α entre los grupos de tratamiento, observamos niveles reducidos de eIF2α fosforilado (Fig. 2d, panel superior) en mosquitos inyectados con dsRNA GCN1 en relación con mosquitos inyectados con dsRNA GFP en todos los puntos de tiempo (Fig. 2e); sin embargo, esta disminución no fue significativa en ningún momento medido (sin alimentación: ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9732; 6 h PBM: ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9340; 12 h PBM: ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9890, 24 h PBM ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9506). Los niveles de eIF2α total y actina, utilizados como controles de carga, fueron similares en ambos tratamientos (Fig. 2d, paneles central e inferior), lo que nos dio confianza de que la disminución de la fosforilación de eIF2α que observamos en los mosquitos inyectados con dsRNA de GCN1 se debió a nuestra eliminación tratamiento.

Alimentamos mosquitos alimentados con sangre inyectados con GCN1 dsRNA y GFP dsRNA 5 días PI, y luego tomamos muestras de grupos de mosquitos en diferentes puntos de tiempo PBM para el análisis qRT-PCR de la expresión de vg. Observamos un aumento de 2000 veces en vg mRNA 24 h PBM en relación con el estado no alimentado en mosquitos inyectados con GFP (Archivo adicional 1: Figura S3b). Curiosamente, no observamos una reducción en la expresión de vg en los mosquitos inyectados con GCN1 en relación con los mosquitos inyectados con GFP, ya que el ARNm de vg aumentó casi 3800 veces en los mosquitos inyectados con dsRNA de GCN1 (Archivo adicional 1: Figura S3b). La expresión de ARNm de vg no fue significativamente diferente en ningún momento medido (sin alimentación: prueba t no pareada, t(4) = 1,299, P = 0,2637; 6 h PBM: prueba t no pareada, t(4) = 0,2851, P = 0,7897; PBM de 12 h: prueba t no pareada, t(4) = 1,275, P = 0,2713; PBM de 24 h: prueba t no pareada, t(4) = 0,1612, P = 0,8797).

Para determinar los efectos de la eliminación de GCN1 en la fecundidad de los mosquitos, inyectamos mosquitos hembra con GCN1 o GFP dsRNA y luego diseccionamos ovarios de grupos de hembras no alimentadas (0 h PBM) y alimentadas con sangre a las 24, 48 y 72 h PBM (Fig. 3a). La longitud de los ovarios creció a un ritmo mayor en los mosquitos inyectados con GCN1 durante las primeras 48 h PBM, siendo las longitudes significativamente diferentes a las 24 h PBM (24 h PBM: prueba t no apareada, t(18) = 2,333, P = 0,0314 ; 48 h PBM: prueba t no pareada, t(18) = 0,8753, P = 0,3930). Sin embargo, los ovarios de mosquito inyectados con GCN1 dejaron de crecer de 48 a 72 h PBM, cuando fueron superados en longitud por los ovarios de hembras inyectadas con GFP, aunque la diferencia no fue significativa (prueba t no pareada, t (18) = 1.982, P = 0.0629) (Fig. 3b). Las longitudes de los ovocitos no fueron diferentes en ningún momento medido (sin alimentación: prueba t no pareada, t(18) = 1,571, P = 0,1335; 24 h PBM: prueba t no pareada, t(18) = 1,339, P = 0,1972; 48 h PBM: prueba t no pareada, t (18) = 0.09389, P = 0.9262, 72 h PBM: prueba t no pareada, t (18) = 0.4433, P = 0.6628) (Fig. 3c).

La caída de GCN1 afecta la fecundidad de los mosquitos. a Ovarios representativos con imágenes de mosquitos a los que se les inyectó dsRNA de GCN1 o dsRNA de GFP en los tiempos indicados PBM. Barras de escala en cada imagen: 500 µm. b, c Se midieron las longitudes de los ovarios (b) y las longitudes de cinco ovocitos representativos (c) de 10 mosquitos inyectados con dsRNA GCN1 (n = 10) o 10 inyectados con dsRNA GFP (n = 10) muestreados a las 0 h PBM (sin alimentar) , 24 h PBM, 48 h PBM o 72 h PBM. Los datos se presentan como la longitud promedio de los 10 pares de ovarios (b) u ovocitos (c) ± error estándar de la media. Se utilizaron pruebas t pareadas para determinar la significación estadística de las diferencias entre las longitudes de ovario y ovocito inyectadas con dsRNA de GCN1 y dsRNA de GFP en cada punto de tiempo. d Número de huevos de mosquitos inyectados con dsRNA GFP (n = 18) y GCN1 dsRNA (n = 23). Las hembras inyectadas con dsRNA individuales se alimentaron con sangre 5 días PI y se separaron en cámaras de puesta de huevos individuales. El papel de huevo con huevos depositados se recolectó 96 h PBM y se desecó durante 48 h antes del conteo. Cada punto representa el número de huevos puestos por un solo mosquito. Las líneas y los bigotes representan la mediana del número de huevos ± rango intercuartil (IQR). e Tasas de eclosión de 12 (n = 12) nidadas seleccionadas al azar de mosquitos inyectados en la parte c. Las líneas y los bigotes representan la mediana del porcentaje de huevos eclosionados por nidada ± IQR. La significación estadística (P < 0,05) del número de huevos y los datos de la tasa de eclosión se determinó con las pruebas U de Mann-Whitney usando el software GraphPad Prism 8

Medimos los tamaños de nidada de mosquitos inyectados con mosquitos GCN1 dsRNA (n = 23) y GFP dsRNA (n = 18). La caída de GCN1 provocó una reducción significativa (prueba U de Mann-Whitney, U(39) = 92,50, Z = − 3,01, P = 0,0021) en el tamaño de puesta en comparación con los controles inyectados con GFP, con una mediana de 63 huevos por puesta en el Grupo de tratamiento GCN1 en comparación con una mediana de 88,5 huevos por puesta en el grupo de control GFP (Fig. 3d). También medimos las tasas de eclosión de 12 nidadas seleccionadas al azar de mosquitos de control inyectados con GCN1 knockdown y GFP dsRNA. Las nidadas de mosquitos derribados con GCN1 tuvieron una tasa de eclosión porcentual promedio del 53 % y las nidadas de control tuvieron una tasa de eclosión porcentual promedio del 75 %. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (prueba U de Mann-Whitney, U (22) = 44, Z = − 1.62, P = 0.1135) (Fig. 3e).

En este estudio, identificamos un nuevo conjunto de proteínas señalizadoras que probablemente forman parte del sensor de nutrientes en el cuerpo graso, los ovarios y otros tejidos del mosquito [6, 30, 31, 35, 36, 45, 55, 56]. Descubrimos GCN1 como un socio de interacción putativo del extremo C de un CAT y demostramos que la caída de GCN1 afecta la señalización de nutrientes inducida por aminoácidos y la fecundidad de los mosquitos.

Comenzamos nuestro estudio volviendo a anotar las cinco proteínas CAT de mosquitos de la familia de genes transportadores de aminoácidos de tipo SLC7 [32, 34, 57]. La base de datos de genes del NCBI contiene dos entradas distintas para Ae. aegypti CAT2 y CAT3 (AaCAT2, AaCAT3), y ninguna entrada para Ae. aegypti CAT1 o CAT5 (AaCAT1, AaCAT5). Nuestro análisis (Fig. 1a) respalda la nueva anotación de la entrada del gen CAT2 (GeneID: 5575859) como CAT1, y la entrada del gen CAT3 (GeneID: 5575110) como CAT5. Tanto AaCAT1 como AaCAT3 se agruparon junto con D. melanogaster Slif (Fig. 1a), lo que indica que AaCAT1 y AaCAT3 representan una expansión de la familia Slif CAT durante la historia evolutiva de Ae. aegypti. En estudios anteriores mostramos que estas dos proteínas estrechamente relacionadas son transportadores de aminoácidos pero con especificidades de sustrato completamente diferentes. Si bien AaCAT3 tiene una amplia especificidad de sustrato y transporta no solo los cuatro tipos de aminoácidos catiónicos, sino también varios sin carga [35], AaCAT1 es un transportador específico de histidina único que forma parte del sensor de nutrientes del cuerpo graso [36]. Debido a que se ha demostrado que la eliminación de AaCAT1 interfiere con la señalización de nutrientes del cuerpo graso, colocándolo en la parte superior de la vía de señalización del objetivo de la rapamicina (TOR) [30], elegimos el extremo C de AaCAT1 como cebo para identificar las proteínas citoplasmáticas que interactúan.

Nuestra pantalla de dos híbridos de levadura del extremo C de AaCAT1 produjo 33 aciertos de proteínas que consideramos como interactuadores plausibles de AaCAT1. Muchos de estos podrían ser verdaderos interactuadores de AaCAT1 y serán candidatos para estudios adicionales. En general, la colección de proteínas que interactúan fuertemente que identificamos (Fig. 1c) sugiere la posibilidad de que AaCAT1 sea parte de un complejo diseñado para administrar la distribución de carga asociada con el transporte de aminoácidos cargados y para regular una variedad de reacciones metabólicas.

GCN1 fue el candidato más interesante que identificamos, debido a su participación en la regulación de la síntesis de proteínas durante la inanición de aminoácidos en eucariotas [9, 10, 11, 12, 14, 15, 53, 58]. Validamos esta interacción entre AaCAT1 y GCN1 mediante el uso de pull-downs in vitro con cebo AaCAT1 marcado con His y presas de lisado de proteínas. Esto no excluye la posibilidad de que otra proteína pueda unir esta interacción. Para confirmar completamente que se trata de una interacción directa, será necesario realizar pull-downs in vitro con cebo AaCAT1 purificado y presas GCN1. Sin embargo, nuestra detección de esta interacción a través de múltiples ensayos nos da la confianza de que es probable que ocurra in vivo, independientemente de si la interacción es directa o en puente. En la levadura, GCN1 forma un complejo con varias proteínas, incluida la quinasa, GCN2, y este complejo se une a los ribosomas donde GCN2 puede detectar y activarse por ARNt sin carga durante condiciones de inanición de aminoácidos [12,13,14,15]. Una vez activado, GCN2 fosforila la subunidad alfa del complejo del factor 2 de iniciación de la traducción eucariota (eIF2α) [12,13,14,15,16], lo que da como resultado la regulación a la baja de la traducción general y la estimulación de la traducción de un pequeño conjunto de genes, incluido el factor de transcripción ATF4 (control general no depresible 4 [GCN4] en levadura), que regulan el metabolismo de los aminoácidos [20, 21, 59]. Además, esta vía de señalización se ha implicado en la regulación de la actividad de mTOR en eucariotas [23, 26]. Investigaciones anteriores han demostrado que la señalización de mTOR es central durante la vitelogénesis de los mosquitos [6, 31, 45, 55], y se ha demostrado que la disponibilidad de aminoácidos afecta la actividad de mTOR y S6K en Ae. aegypti [30,31,32, 45].

Debido a que la región de interacción AaCAT1 se encuentra en el extremo C-terminal de GCN1 y no se superpone con los sitios de interacción ribosomal o GCN2 en la levadura [14, 60], proponemos que la interacción de GCN1 con AaCAT1 puede servir como un sitio de acoplamiento para los ribosomas. Interactuar de esta manera permitiría a GCN1 detectar rápidamente cambios en el estado de aminoácidos de la célula y aumentar la eficiencia de la traducción de YPP al reclutar ribosomas en áreas de alta concentración de aminoácidos. También es posible que la interacción con GCN1 sea necesaria para la activación de AaCAT1 o el mantenimiento de la estabilidad del transportador durante la vitelogénesis, pero nuestros datos de eliminación de GCN1 no respaldan esta noción. Sin embargo, esta posibilidad no se puede descartar sin más ensayos de actividad de AaCAT después de la caída de GCN1. La interacción que observamos entre AaCAT1 y GCN1 puede tener lugar en varias ubicaciones subcelulares. Primero, GCN1 y AaCAT1 pueden interactuar en la membrana plasmática de la célula. En segundo lugar, GCN1 y AaCAT1 pueden interactuar en las vesículas secretoras a medida que AaCAT1 se transporta a la membrana celular. Finalmente, GCN1 y AaCAT1 pueden interactuar en los lisosomas. Esta ubicación de interacción es posible, ya que se predice que AaCAT1 se ubicará en la membrana celular o en los lisosomas (archivo adicional 1: Figura S1), y se sabe que los lisosomas sirven como un sitio de almacenamiento de aminoácidos [61] y un centro para amino señalización ácida por la vía TOR [62, 63]. Se requieren más estudios para dilucidar qué relaciones pueden existir entre GCN1, mTOR y los lisosomas durante la vitelogénesis y dónde tienen lugar estas interacciones dentro de la célula. Para comprender cómo GCN1 puede cruzarse con la señalización de mTOR, un estudio de dos híbridos de levadura que utiliza fragmentos de proteína GCN1 como cebo puede identificar interacciones entre GCN1 y proteínas en la vía de señalización de mTOR. Además, el advenimiento de la edición de genes de la proteína 9 asociada a CRISPR/repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR/Cas9) y técnicas como la transducción de carga mediada por receptores (REMOT Control), que permite el uso de CRISPR/Cas9 para desarrollar genes líneas mediante la inyección de mosquitos hembra adultos [64], hace factible la generación de líneas knockout de proteína de vía de señal GCN1 o mTOR. Esto puede permitir el diseño de experimentos en un fondo genético nulo de señalización de GCN1 o mTOR que puede aclarar aún más cómo GCN1 y la vía GAAC pueden interactuar con la señalización de mTOR para regular la vitelogénesis. La edición basada en CRISPR/Cas9 también puede aprovechar la reparación dirigida por homología para insertar etiquetas fluorescentes con precisión en los genes de señalización GCN1 o mTOR, lo que permite el uso de técnicas fluorescentes, como la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), para identificar si GCN1 interactúa directamente con mTOR u otras proteínas de señalización de mTOR en Ae. aegypti grasa corporal u otros tejidos en diferentes momentos antes y durante la vitelogénesis.

La densitometría de banda de transferencia Western de eIF2α fosforilado normalizado a eIF2α como control de carga mostró una disminución significativa en la fosforilación de eIF2α 6 h PBM en mosquitos inyectados con GCN1 dsRNA o GFP dsRNA (Fig. 2d, e). Este cambio es de esperar si la vía GAAC está involucrada en la sensación de nutrientes a medida que los mosquitos hembra pasan de una dieta baja en aminoácidos de sacarosa (en el laboratorio) o néctar (en la naturaleza) a una comida de sangre con un alto contenido de aminoácidos. Interpretamos este resultado para indicar que la vía GAAC está desempeñando un papel activo en la mediación del cambio metabólico para producir YPP al inicio de la vitelogénesis. Al analizar un efecto de la caída de GCN1 en la actividad de la vía GAAC, observamos una disminución de la fosforilación de eIF2α en mosquitos inyectados con dsRNA de GCN1 en relación con mosquitos inyectados con dsRNA de GFP antes de la comida de sangre y en las primeras 24 h PBM (Fig. 2d, e) . El análisis estadístico de esta disminución no reveló un efecto de eliminación significativo en la fosforilación de eIF2α. Se ha demostrado que la actividad de la quinasa GCN2 está regulada por el tallo P ribosómico en otros eucariotas [65, 66], por lo que es posible que la redundancia funcional en la activación de GCN2 por los tallos P del ribosoma del mosquito pueda explicar por qué observamos una reducción no significativa de Fosforilación de eIF2α después de eliminar la expresión de GCN1.

Curiosamente, mientras que la eliminación de GCN1 no afectó la expresión del ARNm de vg detectado por qRT-PCR (Archivo adicional 1: Fig. S3b), observamos diferencias en la fecundidad de los mosquitos hembra inyectados con GCN1 dsRNA en relación con los controles de GFP dsRNA (Fig. . 3). Anteriormente, hemos publicado datos de fecundidad y tasa de eclosión utilizando tamaños de muestra comparables a los que se utilizaron en el presente estudio [67], por lo que, si bien estamos seguros de que nuestros datos representan con precisión el efecto de la caída de GCN1 en la fecundidad, los experimentos futuros están diseñados para comprender la precisión. El papel desempeñado por GCN1 en la fecundidad de los mosquitos incluirá tamaños de muestra más grandes. La eliminación de GCN1 no debería inhibir otros factores que se sabe que son necesarios para la transcripción del gen YPP, incluida la señalización de 20-hidroxiecdisona (20-E), la señalización de hormonas juveniles o la señalización de péptidos similares a la insulina [31]. Proponemos tres posibles explicaciones de cómo la caída de GCN1 puede afectar el tamaño del embrague sin afectar la transcripción del gen YPP en los experimentos que realizamos. En primer lugar, estos resultados podrían deberse a la redundancia funcional en la activación de GCN2 por las proteínas del tallo P ribosomal. En segundo lugar, estos resultados pueden deberse a una mayor traducción de proteínas en mosquitos tratados con dsRNA de GCN1 antes de la comida de sangre que agotó las reservas de aminoácidos antes de la comida de sangre, lo que provocó una eficiencia reducida en la síntesis de YPP. En tercer lugar, la caída de GCN1 puede causar un reclutamiento desordenado de ribosomas durante la vitelogénesis, lo que reduce la eficiencia de la síntesis de YPP. Futuros estudios metabolómicos y proteómicos, y estudios de purificación de ribosomas en mosquitos silenciadores de GCN1 proporcionarán información sobre cuál de estos mecanismos puede desempeñar un papel en el cambio en la fecundidad mediado por GCN1.

Nuestro análisis de la localización de GCN1 mostró que GCN1 se expresa en niveles más altos en los tejidos involucrados en el procesamiento de los nutrientes de la sangre y la vitelogénesis, particularmente en los ovarios, el cuerpo graso y el intestino medio. Curiosamente, en el intestino medio de mosquitos hembra no alimentados, detectamos ARNm de GCN1 con qRT-PCR, pero no detectamos proteína GCN1 mediante transferencia Western. Nuestra hipótesis es que los tejidos del intestino medio pueden regular la expresión de la proteína GCN1 de una manera diferente a la de otros órganos metabólicamente importantes, como por ejemplo mediante la regulación postranscripcional, ya que las células del intestino medio no almacenan tantos nutrientes como el cuerpo graso y los ovarios y solo pueden requerir actividad de GCN1 en puntos transitorios alrededor de la alimentación de sangre. Deben diseñarse estudios futuros para determinar si el ARNm de GCN1 es secuestrado o dirigido por microARN en este tejido. Nuestra observación de una mayor expresión de GCN1 detectada por qRT-PCR y transferencia Western en ovarios en relación con otros tejidos femeninos adultos (Fig. 2a) indica que GCN1 desempeña un papel importante en el metabolismo de los ovarios, que debe investigarse. Es probable que GCN1 realice una función similar tanto en los ovarios como en el cuerpo graso, ya que ambos tejidos experimentan cambios metabólicos significativos durante la vitelogénesis. También puede ser que el GCN1 endógeno en los ovocitos sirva para regular el metabolismo de los aminoácidos durante la embriogénesis. Recientemente, GCN1 se ha implicado en la regulación de la proliferación celular de forma independiente a GCN2 en células embrionarias de ratón establecidas a partir de embriones mutantes en GCN1 [58]. Será necesario realizar estudios futuros, incluida la determinación directa del efecto de eliminación de GCN1 en tejidos específicos, para determinar el papel exacto que desempeña la interacción AaCAT1-GCN1 en Ae. vitelogénesis de aegypti.

La identificación de los interactores de AaCAT1 y su participación en las vías de señalización celular proporciona información importante sobre las vías de señalización de nutrientes. Mediante la identificación de las proteínas implicadas en estas vías, pueden diseñarse dianas químicas o inhibidores que sean específicos para las proteínas identificadas. Nuestro análisis de las interacciones de proteínas con solo uno de cinco Ae. aegypti CATs ha revelado una conexión entre AaCAT1 y una segunda vía sensora de nutrientes que no tenía un papel previamente establecido en Ae. Señalización de nutrientes aegypti. Con más interacciones CAT para estudiar, junto con nuestra comprensión cada vez mayor de la actividad de GCN1, nuestra imagen del sistema sensor de nutrientes en los mosquitos solo se está volviendo más compleja.

Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este artículo están disponibles dentro del artículo (y sus archivos adicionales) y del autor correspondiente a pedido razonable.

Transportador de aminoácidos catiónicos de Aedes aegypti 1, 2, 3, 5, respectivamente

Respuesta de aminoácidos

Activación del factor de transcripción 4

Proteína asociada a CRISPR 9

Transportador de aminoácidos catiónicos

Transportador de aminoácidos catiónicos 1, 2, 4, 5, respectivamente

ADN de cortesía

Repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada

Doble abandono (medios)

Dimetilsulfóxido

Trifosfato de desoxirribonucleósido

ARN de doble cadena

Sulfóxido de disuccinimidilo

ditiotreitol

Ácido etilendiaminotetraacético

Subunidad alfa del factor 2 de iniciación de la traducción eucariótica

Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

Control general de aminoácidos

Control general no depresible 1, 2, 4, 20, respectivamente

Proteína fluorescente verde

Transportador de aminoácidos heterodiméricos

Octilfenoxipoli(etilenoxi)etanol, ramificado

Análisis de genética evolutiva molecular

ARN mensajero

Objetivo mecánico de la rapamicina

Objetivo mecánico del complejo de rapamicina 1

hace millones de años

Centro Nacional de Información Biotecnológica

Transcripción no inversa

Desoxitimidina oligomerizada

Proteína ribosomal S6 quinasa beta-1

Después de la comida de sangre

Post-inyección

difluoruro de polivinilideno

Abandono cuádruple (medios)

PCR de transcripción inversa cuantitativa

Transducción de carga mediada por receptor de ovario

interferencia de ARN

Proteína ribosómica S7

Medios sintéticos definidos

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

Familia de transportadores de solutos 7

Adelgazar rapidamente

Tampón EDTA de tris-acetato

Solución salina tamponada con Tris

Solución salina tamponada con Tris + Tween-20 al 0,05 %

Objetivo de la rapamicina

ARN de transferencia

vitelogenina

Proteína precursora de yema

20-hidroxiecdisona

6-histidina

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El siguiente reactivo fue proporcionado por el NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center para su distribución a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool, Eggs, NR-48921. El plásmido 3' EGFP pXOON fue proporcionado por el Dr. Dmitri Boudko. Los autores agradecen a Carolyn Armendáriz y Hailey Luker por su ayuda con la crianza de mosquitos, ya Harley Bendzus-Mendoza por su ayuda con el análisis estadístico.

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones n.° 5SC1GM125584 y n.° 1R35GM144049 del Instituto Nacional de Salud, el Programa de Becarios Postdoctorales de NMSU, el Instituto Médico Howard Hughes de NMSU y el Programa de Becarios de Investigación de Pregrado de New Mexico Alliance for Minority Participants.

Departamento de Biología, Universidad Estatal de Nuevo México, Las Cruces, NM, EE. UU.

Matthew Pinch, Theodore Muka, Yashoda Kandel, Mahesh Lamsal, Nathan Martinez, Marialuisa Teixeira & Immo A. Hansen

ReCode Therapeutics, Dallas, Texas, EE. UU.

Dmitri Y. Boudko

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MP realizó ensayos de dos híbridos de levadura, ensayos desplegables, qRT-PCR, síntesis de dsRNA, caídas de RNAi, transferencias Western, datos analizados, Figs. 1, 2, 3 y las tablas 1, 2, 3, preparó datos adicionales y escribió el manuscrito. TM realizó ensayos de dos híbridos de levadura, ensayos desplegables, síntesis de dsRNA, caídas de RNAi, analizó datos, preparó Figs. 1 y 3, preparó datos adicionales y escribió el manuscrito. YK realizó caídas de ARNi, imágenes de ovario, analizó datos y preparó la Fig. 3. ML realizó transferencias Western y qRT-PCR. NM realizó transferencias de Western. MT realizó qRT-PCR. DYB contribuyó con reactivos y generó cifras adicionales. IAH contribuido a la concepción de los experimentos y escribió el manuscrito. Todos los autores leen y aprueban el manuscrito final.

Correspondencia a Immo A. Hansen.

No aplica.

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Anotaciones de todas las entradas de CAT utilizadas para el árbol de anotaciones de CAT. Tabla S2. Potenciales interactuadores de proteínas identificados a partir de la pantalla de dos híbridos de levadura AaCAT1. Figura S1. Ae. aegypti AaCAT1 es una proteína transmembrana que se localiza en la membrana plasmática. a. La estructura terciaria de la proteína AaCAT1 se visualizó utilizando PyMOL (https://pymol.org/2/). b. La herramienta de predicción transmembrana TMHMM, Krogh et al. [39] se utilizó para predecir los dominios transmembrana y las regiones intracelular y extracelular de AaCAT1 para diseñar el fragmento de cebo para el análisis de dos híbridos de levadura. C. Se predice que AaCAT1 se localizará en la membrana plasmática según lo determinado por la herramienta de localización subcelular DeepLoc-1.0, Almagro Armenteros et al. [52]. Figura S2. Predicciones in silico de la localización subcelular de GCN1. a. Se prevé que GCN1 se localice en el citoplasma, pero también puede localizarse en el núcleo. b. Las secuencias de localización nuclear previstas (NLS) que se encuentran en GCN1 revelan varias NLS con puntuaciones que indican un patrón mixto de localización nuclear-citoplasmática. C. Resultado de la parte b que muestra la ubicación de la NLS predicha dentro del contexto de la secuencia de aminoácidos de GCN1. La predicción de localización subcelular se realizó utilizando la herramienta de localización subcelular DeepLoc-1.0, Almagro Armenteros et al. [52]. La predicción NLS se realizó utilizando la herramienta de predicción cNLS Mapper, Kosugi et al. [54]. Figura S3. La caída de GCN1 no es letal y no afecta la transcripción de YPP. a. La supervivencia de los mosquitos de control inyectados con GCN1 dsRNA y GFP dsRNA no fue significativamente diferente hasta cinco días después de la inyección. Se usó una prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox para probar las diferencias significativas entre los dos tratamientos. b. Análisis de qRT-PCR de la transcripción de vg en mosquitos de control inyectados con dsRNA GCN1 y GFP dsRNA. Se analizaron tres réplicas biológicas por tratamiento en cada punto de tiempo y los niveles de ARNm de vg se normalizaron a ARNm de β-actina antes de calcular el cambio en la expresión de vg durante las primeras 24 h PBM. Se usaron pruebas t pareadas para probar diferencias significativas entre los dos tratamientos en cada punto de tiempo. Figura S4. Imágenes de Western blot y azul de Coomassie utilizadas en las figuras principales sin recorte, eliminación de color y corrección de brillo/contraste. La etiqueta encima de cada imagen contiene una referencia a la figura principal del texto donde se incluye la imagen.

: Conjunto de datos S1. Libro de trabajo de Excel que contiene todas las secuencias de presa de dos híbridos de levadura de colonias con copias de plásmido de presa única. Cada fila representa el resultado de una única colonia e incluye la secuencia de inserciones presa generadas a partir del promotor T7 en el plásmido presa pGAD-T7.

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Reimpresiones y permisos

Pinch, M., Muka, T., Kandel, Y. et al. El control general no depresible 1 interactúa con el transportador de aminoácidos catiónicos 1 y afecta la fecundidad de Aedes aegypti. Vectores de parásitos 15, 383 (2022). https://doi.org/10.1186/s13071-022-05461-x

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Recibido: 23 de marzo de 2022

Aceptado: 27 de agosto de 2022

Publicado: 21 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-022-05461-x

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